黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究，黄原胶（xanthan gum),又称汉生胶，是野油菜黄 单胞菌（lafltAcrnoflas ca即estris)以碳水化合物为主要原料，经发酵生产的一种用途广泛的微生物胞外多糖。黄 原胶分子由D-葡萄糖D-甘露糖，D-葡萄糖醛酸、乙 酸和丙酮酸构成，经发酵提取后得到的成品为白色或浅 米黄色粉末。它无味、无臭、无毒、食用安全，是 目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性 能最优越的生物胶。黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究，因其具有独特的性质而被广泛地应 用于食品、医药、造纸、纺织、陶瓷、日化用品、 石油开采等2 0多个行业，被誉称为“工业味精”a I 目前，黄原胶的工业生产均采用间歇分批发酵的工 艺，即一次性投料，一次性出料。在整个发酵过程中， 随着黄原胶的积累，发酵液的粘度会迅速增加，对发 酵结果造成许多不利的影响，如：溶解氧限制、发酵 产品质量低、产胶率低等。为此，人们从新设备、新 工艺方面开展了大量地研究，来克服这些负面的影响[>4]。 本文尝试采用分批补料的发酵工艺来改善间歇发酵工艺

的不足，以期望来提高发酵的最终结果。

1 材料与方法 1.1 材料

出发菌株：野油菜黄单胞菌（t/j on 〇 c a s caiupesti'is) QH79，由郑州大学生化工程中心选育。

培养基：

种子培养基：蔗糖1%，蛋白胨0.5%,牛肉膏0. 3%, NaC10.5%, pH 7.0；

发酵培养基：适量淀粉水解液（见试验结果），蛋白 胨0.3%，豆饼粉0.2%，碳酸f丐0.3%，柠檬酸0.1%, pH7.0;

补料培养基：3.20%淀粉水解液，口117.0;13.20% 淀粉水解液，蛋白胨0.05%，pH7.0; c. 20%淀粉水解液， 蛋白胨 0. 1%, pH7. 0。

12 分析方法[5]

总糖的测定斐林法菌体浓度测定 凯氏定氮法；粘度测定 NDJ — 1型粘度计，4号转子，3 0

转，室温下测定；产胶率测定酒精沉淀法。

1.3 培养方法

斜面菌种活化后，接种于种子培养基中，2 8 °C培 养16h后，以5%的接种量接种于发酵培养基中，28°C 培养3d。在发酵培养过程中进行补料试验，具体结果 见结果与讨论。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基DE值的影响

通过前期的试验研究，考察了碳源、氮源、无机 盐和pH等因素的影响，确定了间歇发酵的最适培养基 [5]。在试验过程中，发现在淀粉、蔗糖、葡萄糖三种 碳源中，含蔗糖的培养基发酵结果最好，含淀粉的培 养基次之，而含葡萄糖的培养基中产胶极低。分析原 因，很可能是过高的还原糖浓度会抑制黄单孢菌的生 长，所以，在葡萄糖为碳源的培养基中出现产胶低的 现象。

此外，黄单孢菌具有较强的胞外淀粉酶活性，使 之能够边水解底物边加以利用，不会使发酵液中的还原 糖浓度过高。而蔗糖较淀粉更易水解，从而使菌体能 较快地生长，最终提高发酵结果。考虑到蔗糖价格比 淀粉高，如利用淀粉水解液做为碳源，则既可利于菌 体的生长，又能不产生抑制。故试验首先对发酵培养 基的DE值进行了考察。

利用淀粉酶水解淀粉，考察了不同水解时间下， 不同DE值对产胶的影响，分别以发酵液终粘度和产胶 率做为考察指标，试验结果见表1。从表中可以看出， 淀粉水解20min后，DE值为32. 5%,所得的水解液做为 碳源经发酵后，发酵结果最佳，发酵液终粘度为 lOlOOc.p,产胶率2. 81%。

表1不同DE值对发酵的影响

Table 1 Effect of DE on fermentation

时间(h)0102030405060

DE值026.532.536.441.441.341.2

粘度(103cp)7.838.1410.18.207.407.407.43

产胶率(%)2.382.562.812.672.142.202.20

同时看到，水解时间的进一步增加反而造成了发酵 结果的下降。这也进一步表明：经适当水解的淀粉液因 含有适量的还原糖，使得培养基能更好地使菌体生长来 提高发酵结果，但过高的还原糖浓度会对菌体产生不利 的影响。

2.2 黄原胶分批补料的正交试验

分批补料的发酵过程中，影响发酵结果的因素很 多，主要包括：培养基起始碳源的浓度、补料培养基 的组成、补料的开始时间及补料的方式等等。在前面 试验的基础上，安排正交试验考察了各因素的影响情况

及寻找较优的工艺条件。试验安排如表2

表2L9(34)正交设计因素和水平

Table 2 Factors and levels of orthogonal design L9(34)

水平A

起始碳源浓度(%)B

补料培养基C

补料开始时间(h)D

补料方式

12a24一次全加

23b36恒速流加

34c48指数流加

表中碳源均采用淀粉水解液，补料开始时间分别考 察了发酵培养24、36、48h后开始补料的不同时刻。补 料方式分三种情况，一次全加指在补料开始时，一次 加入剩余的培养基；黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究，恒速补料是从开始补料时刻，每隔 16h均匀加入等体积的补料培养基；指数补料是每隔16h 采用指数流加的方式加入补料培养基。补料过程控制总 糖为6%，发酵时间96h。分别以发酵液终粘度和产胶 率为考察指标进行了 L9 (34)正交试验，结果分别见表3和 表4。

由这两个正交试验可以看出，培养基的起始浓度、 补料起始时间、补料培养基成分和补料方式等不同因素 对黄原胶的合成有不同程度的影响。

首先，在表3中可以看到，各因素对发酵液终粘 度的影响顺序分别为：起始碳源浓度>补料开始时间> 补料方式>补料培养基。

表3 发醇液粘度的正交试验结果

Table 3Experimental results of broth viscosity

序号ABCD粘度(cp)

12a24一次全加9050

22b36恒速流加8900

32c48指数流加8360

43a36指数流加10025

53b48一次全加9450

63c24恒速流加9800

74a48恒速流加8907

84b24指数流加10333

94c36一次全加9967

M1j26310279822918328467

M2j29275286832889227607

M3j29207281272671728718

m1j87709327.397279489

m2j9758.395619630.79202.3

m3j9735.79375.78905.79572.7

Rj988.3233.7821.3370.4

在表4中，各因素对产胶率的影响顺序分别为：补 料方式 > 起始碳源浓度 > 补料培养基 > 补料起始时间。

从试验结果看到，各因素对发酵液终粘度和产胶率 的影响是不完全一致的，这也从另一方面说明了，黄 原胶发酵的复杂性，发酵液终粘度高并不能说明产胶率 就高，而产胶率高的发酵液粘度也不一定很高。究其 原因，这和黄原胶本身分子量的大小及质量有关。所

表4产胶率的正交试验结果

Table 4 Experimental results of yield of xanthan gum

序号ABCD 产胶率(%)

12a24一次全加1.79

22b36恒速流加1.9

32c48指数流加2.5

43a36指数流加2.13

53b48一次全加1.53

63c24恒速流加2.13

74a48恒速流加2.08

84b24指数流加2.55

94c36一次全加2.11

M1j6.1966.475.43

M2j5.795.986.146.11

M3j6.746.746.117.18

m1j2.0622.161.81

m2j1.931.992.052.04

M3j2.252.252.042.4

Rj0.320.2570.1230.59

以，应当对黄原胶的发酵结果综合考虑。通过上述正

交试验结果，得出了对黃原胶生产合成最有利的两种排

列，并对两种排列进行验证试验，结果如表5°

表5验证试验结果

Table 5Validation of the experimental results

序号AB CD粘度(cp) 产胶率(%)

13b 24指数流加110002.6

24c 24指数流加121503.01

从验证试验，可以看出试验2的结果较为理想，最 终可以确定该工艺条件为正交试验的最终结果。起始碳 源浓度为4%的淀粉水解液，因其含有适量的还原糖可 以更快地促进菌体生长，另外，高的C/N (碳氮比）利于 产胶，能使黄原胶尽快积累[3]。

补料起始时间从发酵培养24h后开始为最佳，这主 要是因为黄原胶的合成为典型的Gaden II型。在24h前 内主要为菌体生长期，菌体在该阶段己经达到了最大 值，而24h后主要为产物合成期，所以在24h后补料不 仅满足了菌体维持生长的需要，而且为快速合成黄原胶 提供了合成的原料。过晚补料，很可能会造成部分菌 体养料的缺乏而衰老，所以发酵24h后补料效果最好。

从补料培养基的成分看，适量氮源的加入不仅有利 于发酵液的粘度，而且有利于最终的产胶率。这表明， 氮源的补加，对后期的黄原胶的合成有促进作用。

补料方式的影响很明显，不管从发酵液粘度还是产 胶率看，指数补加方式是最为有效的方式，采用一次 性大量补料方法虽然操作简便，但这种方式会使将发酵 液瞬时大量稀释。扰乱菌体的生理代谢，同时难于控 制过程处在最适合的状态。采取恒速流加的方法，虽 然也比较简单，但同样不能保证菌体处于合适的状态。 由于菌体生长和合成随时间的非线性变化，采用指数补

料具有一定的优越性。

2.3 分批补料发酵与间歇发酵的动力学比较

在不同的发酵工艺条件下，通过分析动力学指标， 可以更加清晰地看出两种工艺的差别。

图2分批补料发酵菌体浓度和总糖浓度变化趋势

Fig.2 Trend of biomass concentration and total sugar concentra¬tion in fed-batch fermentation

图1和图2分别表示了不同工艺条件下菌体浓度和

总糖浓度随发酵时间的变化规律。二者的变化趋势基本 相同。黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究，但分批补料的最大菌体浓度为1.15g/L，要高于 间歇发酵的菌体浓度l.〇8g/L。此外，由于分批补料前 期的总糖浓度较间歇发酵的低，因此，前期的C/N要 低，而较低的C/N比更加有利于菌体的生长，因此24h 前的菌体生长速度要快于间歇发酵。发酵24h后，间歇 发酵的菌体对总糖的得率系数Yx/S为0. 068,而分批补料 的菌体对总糖的得率系数Yx/S为0.074。所以，可以看 出，采取补料的方式对菌体的生长速度和生长量都有一 定的促进作用。

图3给出了补料发酵和间歇发酵两种工艺条件下， 发酵液粘度与产胶率随时间的变化趋势。通过比较可以 看到，在发酵前期，两种工艺条件下的发酵液粘度增 长基本一致，但后期，补料的发酵液粘度持续增长。

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