以黄原胶为原料，进行酸降解，再以氯乙酸为羧甲基化试剂，在适当的条件下进行羧甲基化反应，获得降解 黄原胶羧甲基化衍生物。考察分子质量及酸碱比对产物羧平基含#的影响，确立较优化的羧中基化反应条件。并通过红外 对结构进行了表征。以降解黄原胶羧甲基化衍生物为净化剂，研究其选择清除血浆中低密度脂蛋白(LDL)及纤维蛋白原(Fib) 的性能。结果表明，在pH=5.20,净化剂浓度为2,500mg/L时，可使血浆总胆固醇(TC)下降40%左右，低密度脂蛋白胆 固醇下降45%，纤维蛋白原下降近100%，而总蛋白和高密度脂蛋白(HDL)无明显变化。
心脑血管疾病是威胁人类健康的三大疾病之一。 现已证明人体血液中低密度脂蛋白浓度的升高以及 由此引起LDL在血管壁中的过氧化是动脉粥样硬化 (AS)等心血管病发生的主要原因，降低血液中过高 的LDL能有效地预防和阻止其发生m。纤维蛋白原 (Fib)是血液中重要的凝血因子，含量过高可能会导 致高粘滞血症及各种心脑血管疾病。大幅度的清除 Fib对改善血液流变指标、改善血液状况和防治高 粘滞血症具有积极作用[21。目前血液LDL净化方法 主要包括血浆置换、膜过滤、免疫亲合吸附、物 理化学吸附及肝素诱导沉淀等技术。目前对诱导沉 淀的研究多集中于类肝素物质如磺化多糖类物质[\ 黄原胶是甘兰黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas Camparis)所产生的-种胞外多糖，具有聚p -1，4- P比 喃型葡萄糖的主链以及含糖的侧链如丙酮酸和乙酸 基因，其聚合物骨架结构类似于纤维素，侧链上的 葡萄糖醒酸和丙酮酸群赋予了黄原胶负电荷。整个 分子结构中则含有大量的伯、仲醇羟基。通过羧甲基化反应可以使所得衍生物具有大量羧基。降解黄 原胶羧甲基化衍生物应用于血浆脂蛋白诱导沉淀技 术未见报道H1。
本文以黄原胶为原料，通过降解、羧甲基化研 制出新型血浆净化剂。研究和讨论了降解中酸浓 度、降解时间、降解温度对多糖分子质量的影响。 羧甲基化反应中分子质量、氢氧化钠和氯乙酸比值 对羧甲基含量的影响。以降解黄原胶羧甲基化衍生 物为净化剂，考察用量、净化体系pH值对净化效 果的影响，确定较优的净化条件。
1材料与方法
1.1原料与试剂
黄原胶(上海化学试剂站分装厂）、新鲜猪血、 透析袋(截留分子质量3,500，上海源聚生物科技有 限公司)、氯乙酸(AR，中国医药集团上海化学试剂 公司）、氢氧化钠、盐酸、醋酸钠、冰醋酸、乙 醇、异丙醇等试剂为市售分析纯或化学纯。
722分光光度计；恒温水浴锅(HH-2A>电动离 心机(80-2>循环水式真空泵(SH2-D型> 真空干燥 箱(DZF-6020塑)；精密酸度计(PHS-3C型>，乌式 粘度计。
1.2实验方法
1.2.1降解黄原胶的制备
取一定量的黄原胶分散于l〇〇mL乙醇溶液中， 置于250mL三口烧瓶。加人一定量的HC1，在一定 温度下恒温水浴，揽拌使黄原胶分散均匀，反应停 止后抽滤再置于60弋烘箱中烘干。
1.2.2羧甲基降解黄原胶的制备【5】
取2.5g降解黄原胶加入装有撹拌及回流冷凝装 置的250mL三口烧瓶中，加人50mL95%异丙醇溶 液，搅拌条件下加人一定量NaOH固体粉末。于室 温(20 下经行碱化反应。
1 h后在搅拌条件下缓慢加人溶有一定量氯乙酸 的异丙醇10mL，50丈水浴下反应2h，再加人 2gNaOH粉末，反应lh〇
反应结束后将产物倒出，倾去上清液，以1:1 HC丨调节体系pH为7,再以90%乙醇清洗3次，抽 滤，于60^下烘干。
1.2.3纯化处理
将干燥后的羧甲基降解黄原胶溶于去离子水后移 入透析袋中，以去离子水充分透析，直至透析液以
AgN03溶液检验无cr检出。透析液浓缩后在50弋 下真空干燥至恒重，即获得纯净的降解黄原胶羧甲
基化衍生物。
1.2.4血浆LDL及Fib的诱导沉淀
以冰醋酸和醋酸钠配制不同pH值的HAC-NaAC 缓冲溶液，同时将不同质量的竣甲基降解黄原胶溶 解其中，获得不同浓度不同pH值的净化剂缓冲溶 液。取一定体积的血浆，按1:1体积比加入上述净 化剂缓冲溶液中，体系有沉淀物形成。于3,000rpm/ min下离心分离沉淀物，取上清液分析血浆总胆固 醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇((HDL-C)、纤维蛋白 原(Fib)及血浆总蛋白质(TP)等指标。
1.3分析指标与方法
13.1降解黄原胶的相对•分子质量粘度法测定[61。 1.3.2测定产物羧甲基含量指示剂酸碱滴定法m。 1.3.3红外光谱分析常规KBr压片法。
1.3.4血浆(血清)总胆固醇浓度(CTC)乙醇抽提，磷 硫铁显色法[8]。
1.3.5高密度脂蛋白胆固醇浓度(CHDI^Ch)磷钨酸钠- Mg2+沉淀，磷硫铁显色法[9]。
1.3.6低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白胆固醇浓度(Ci Ch+VU3L.Ch)由计算得到：Cu>K；h+VLDL"Ch=CTC-CHDL-Co 1.3.7血浆(血清)总蛋白质浓度(Cn〇雜脲显色法[丨0丨。 1.3.8血浆纤维蛋白原浓度(CF,b)亚硫酸钠沉淀-双 缩脲显色法[1<)1。-
1.3.9 清除百分率(RP%) RP=(CB-CA)/CB *100。
式中C为血清或血浆中TC、HDL-Ch、LDL- Ch+VLDL-Ch的浓度，mg/L;下标A、B分别为 净化后及净化前。
2结果与讨论
2.1降解黄原胶的制备条件优化
以水浴降解黄原胶各单因素试验为依据，选择 酸浓度、反应时间、反应温度为考察因素，随机 安排各因素的水平顺序。并以粘度为降解结果考察 依据(见表1、表2)。
表1正交实验的因素与水平
因素123
A HC 丨浓度(mol.L“）0.100.150.20
B温度(<C)506070
C加热时间(h)1.01.52.0
由正交实验极差分析可得，各个因素对产物粘 度影响的大小顺序为：酸浓度>反应时间>反应温
表2正交实验结果
试验号A HC1 浓度(mol，L_l)B温度(<C)C加热时间(h)粘度(Pa • s)
10.10501.01.62
20.10601.51.43
30.10702.01.16
40.15502.01.18
50.15601.01.25
60.15701.51.36
70.20501.51.42
80.20602.01.33
90.20701.01.44
K14.204.224.29
K23.793.744.21
K34.193.963.67
R1.040.480.63
氢氧化钠与氯乙酸用量比对取代度的影响如图2所示。
度。优化实验条件为：酸浓度为0.1 5mol • I/1， 60^下水浴加热2h。
2.2羧甲基化实验条件的优化
由于黄原胶粘度较大，过高的温度，反应时间 过长或反应体系水含量较多都会使反应物糊化结 块，使得反应无法进行，所以根据实验将反应温度 控制在501，并采用干法制备，直接加人固体的 氢氧化钠[51。
2.2.1黄原胶分子质量对羧甲基化取代度的影响 固定黄原胶用量为2.5g,氢氧化钠用量为 10g,氯乙酸用量为10g,碱化时间lh,醚化时间 3h,二次加碱量为氢氧化钠2g,反应温度50^。 黄原胶分子质量对羧甲基取代度的影响如图1所示。
由图1可知，随着黄原胶分子质量的减小，反 应更易进行，所得产物羧甲基取代度更高，因黄原 胶原胶分子质量较大，在一百万左右。而降解至两 万以下羧甲基化反应便可较易进行。
2.2.2氯乙酸与氢氧化钠用量比对羧甲基化取代度的 影响
固定黄原胶用量为2.5g，分子质量为180,000, 碱化时间为lh,醚化时间为3h,反应温度为50丈，
图2 NaOH:MCAA对取代度的影响 由图2可知，当氯乙酸的用量增加时，多糖分 子附近的酸浓度增大，因此羧甲基化的程度增大， 但当氯乙酸过多会与氢氧化钠反应引起反应体系温 度迅速升高，使得部分溶剂异丙醇挥发损失，体系 中醇水比例发生改变，新生成的产品会很快溶胀、 结块使反应无法进行，造成狻甲基取代度下降，所 以，一般取氢氧化钠与氯乙酸的比值为2:1.8。 2.2.3降解黄原胶羧甲基化衍生物的红外表征 .FTIR谱图3中的l,637cm“为结合水峰，1,022
及1，421 cm—1出现了-COO-的对称和非对称伸缩振动蛋白净化效果随降解黄原胶羧甲基化衍生物浓度的 峰，表明羧甲基连接到了黄原胶分子上。变化关系。
2.3降解黄原肢羧甲基化衍生物來度和净化体系pH 对血浆净化效果的影响
影响LDL诱导沉淀的主要因素包括净化剂浓度 和体系pH值。下面将分别考察两者对血浆净化效果 的影响。
2.3.1降解黄原胶羧甲基化衍生物浓度对血浆脂蛋白 净化效果的影响
用含有不同浓度的降解黄原胶羧甲基化衍生物 的缓冲溶液，按1:丨体积比与已去除血细胞的血浆 混合进行净化，考察净化剂浓度(CPA)对血浆脂蛋白
实_验中观察到，在一定pH坏境下，随净化剂 浓度增大，血浆TC及LDL净化率增加。在体系 pH=5.20时，随着净化剂溶度增大至2,500mg/L，可 使TC下降40%左右，LDL和VLDL下降45%左右， 而对HDL的清除率小于25%，并不显著。这是由 于LDL和HDL的载脂蛋白的种类、组成及空间结 构存在较大差异所致。LDL的载脂蛋白为apolipopr- otein-B(Apo-B)，Apo-B富含赖氨酸、精氨酸和组氨 酸等碱性氨基酸残基，且多暴露于载脂蛋白表面。 而 HDL 的载脂蛋白为 apolipoprotein-A(Apo-A)，亦 含有一定量的赖氨酸，但其暴露在HDL分子表面的 比率较小。HDL等电点低于LDL，故在相同pH环 境下，HDL所带的正电荷比LDL少，其与聚阴离 子形成不溶性复合物的能力较LDL低。当体系 pH=5.20近似于LDL的等电点时，随着聚阴离子降 解黄原胶羧甲基化衍生物的加入，可以促使其聚 沉。另外，LDL的分子质量及尺寸均较HDL大， 在等电点处更容易聚集。
此外，Fib是一种纤维状蛋白质高分子，其等 点电约为pH=5.5。当体系pH值低¥其等电点时， Fib整体带正电荷，容易与聚阴离子形成复合物絮 凝沉淀出来。通过实验发现，体系pH=5.10以及体 系pH=5.20时，净化剂溶度分别为l,500mg/L、2,000 mg/L、2,500mg/L时，在所取上清液中加人适量的 亚硫酸钠溶液均没有形成沉淀，表明此时Fib的清 除率接近100%。
2.3.2净化体系pH对血浆脂蛋白净化效果的影响 净化体系pH是影响净化剂诱导沉淀LDL及Fib 的另一个重要因素，在净化剂浓度一定的条件下， 改变净化体系的pH值，考察其对血液净化效果的影 响，结果如图6所示。
由图可得：随着pH下降，TC、LDL及Fib 的清除率将提高。这是由于体系pH环境决定了血浆 蛋白质的荷电数，故对蛋白质与净化剂相互作用有 重要的影响。在pH低于5.1后的HDL及TP的清除 率都较高，所以选取PH=5.20作为净化的优化pH 值，在此体系下可大幅度清除TC、LDL,而对TP 及HDL的清除率并不显著。
pH
图6净化体系pH对血浆净化效果的影响(n=5)
2.4.3净化效果测定体系下，对15个血浆样本进行净化实验，净化结
取净化剂浓度为2,500mg/L/在pH=5.20的净化果如表3所示。
表3降解黄原胶羧甲基化衍生物对血浆中脂蛋白的净化效果(n=l5)
TCHDL-CLDL-CTP
净化前(mg/dL)121.4 ± 16.340.6 ±5.180.9 ± 14.559.2 土 7.1
净化后(mg/dL)75.1 土 10.529.9 ± 4.943.9 ± 8.850.7 土 6.7
清除率39%24%46%14%
3结论
以黄原胶为原料，首先进行酸降解，再以氯乙 酸为羧甲基化试剂，对其进行羧甲基化，可以获得 降解黄原胶羧甲基化衍生物。通过正交实验得到： 降解黄原胶的优化条件为酸浓度为〇.15mol •!/、 60T水浴加热2h，使其分子质量降到两万以下，羧 甲基化反应的较优条件为反应温度50丈，干法制 备，直接加人固体的氢氧化钠，氢氧化钠与氯乙酸 的比值为2:1.8。
以这种新型降解黄原胶羧甲基化衍生物为净化 剂，研究其选择净化血液低密度脂蛋白(LDL)及纤 维蛋白原(Fib)的性能，得到较优净化条件为：体系 pH=5.20,净化剂浓度为2,500mg/L时，可使TC下 降40%左右，LDL和VLDL下降45%，Fib下降接 近100%，而HDL和TP下降小于25%，无显著变 化。说明降解黄原胶衍生物具有良好的选择净化性 能，是一种新型LDL/Fib净化剂。
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