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菌株对玉米秸秆木质素和纤维素降解能力的研究

发布日期:2015-04-04 13:54:42

菌株

为了探讨菌株的产酶活性及其对玉米秸秆中木质素和纤維素的降解能力,以羧甲基纤維 素钠为诱导物配制培养基I,以不加羧甲基纤維素钠为对照配制培养基II,分别接种F,菌株在 25 °C下培养诱导产生纤維素降解酶Cx,用分光光度法测定不同时间所产生的酶活。将培养5d的 F,菌株以10%的接种量转接到玉米秸秆固体发酵培养基上培养,在5d、10d、15d、20d用差重法测 定卩,菌株对玉米秸秆中半纤維素、纤維素和木质素的降解能力。结果表明,以羧甲基纤維素钠为 诱导物培养基Fi菌株能够产生Cx S酶而且在第5天时酶活性最强。Fi菌株在玉米秸秆发酵培养 基中的生长情况良好,培养前15d, F,菌株对纤維素和木质素的降解都很快,之后对纤維素的降解 速率明显降低甚至停止降解。培养20d,对半纤維素、纤維素和木质素的累计降解速率为3.5%、 10.5%、7. 0%。

 供试菌株
Fi菌株由河南科技大学林学院植保系植物免疫 研究室提供,在4 °Q水箱保存备用。
1.2供试培养基
1.2.1 PDA培养基参照文献[4]配制PDA培
养基。
1.2.2纤维素降解酶诱导培养基诱导纤维素降 解酶形成的不同培养基配方见表1。在制作过程 中,应先用适当的水加热溶解羧甲基纤维素钠,再溶 解其他物质,后调pH值15。每个三角瓶(200mL) 加液体培养基100mL,高压蒸汽灭菌30min。
表1诱导纤维素降解酶形成的不同培养基配方
化学物质培养基I培养基II
KNO3(g)2.02 0
KCl(g)0.50 5
FeSO4(g)0. 010 01
K2HPO4(g)1.01 0
MgSO4 D 7H2O(g)0 50 5
维生素B|(mg)0 20 2
L一天冬酰胺(g)
羧甲基纤维素钠(g) 去离子水(mL)0 5 1 00005
1000
pH5.05 0
1.2.3玉米稻秆发酵培养基称取3. 00g玉米稻 秆粉(取自河南科技大学周山校区试验田,经干燥、 粉碎,过孔径为0. 9mm的分样筛)加入到20个 250mL的三角瓶中,分别加入0.02g CaS〇4、0.06g MnS〇4、15mL自来水,混匀,121 ~ 125 Q灭菌 30 min 备用1 fl]。
1.3 溶液配制
1.3.1醋酸一醋酸钠缓冲溶液取0. 05mol/ L醋
酸钠(AR)溶液(称取4. 1015g无水醋酸钠溶解于适 量的水中并定容1000mL)—定量,加入0. 05mol/L的 醋酸(AR),用25型酸度计调pH至5.0。
1.3.2 1%羧甲基纤维素钠称取1.00g羧甲基 纤维素钠溶于醋酸一醋酸钠缓冲溶液(0.05mol/ L,
pH5. 0)中,定容至 100mL。
1.3.3 DNS显色剂称取3, 5^二硝基水杨酸 6. 3g,2mol/L 的 NaOH 溶液 262mL,加到 500mL 含有185g酒石酸钾钠的热水溶解(温度低于 50 Q)再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶 解。冷却后加蒸馈水定容至1 000mL,放置过夜,过 滤后贮于棕色瓶中备用171。
1. 3.4中性洗涤剂准确称取18. 6g乙二胺四乙 酸二钠和6.8g四硼酸钠,均放入1000mL烧杯中, 加入少量蒸馏水,加热溶解后,再加30g十二烷基 硫酸钠和10mL乙二醇乙醚;称取4. 56g无水磷酸 氢二钠置于另一烧杯中,加入少量蒸馏水加微热熔 解后倒入第一个烧杯中,再转入定量瓶中稀释至 1000mL,此溶液的pH值在6.9~7.1左右|8]。 1.3.5200^g/mL葡萄糖标准液准确称取
0. 1000g分析纯葡萄糖(预先在80Q烘箱中烘干至 恒重),置于小烧杯中,用少量的去离子水溶解后定 量转移到100mL的容量瓶中,以少量的去离子水 定容至刻度,摇匀,再稀释成200,ug/mL,置冰箱中 保存备用9。
1.4测定方法
1.4.1葡萄糖标准曲线的制作参照文献[9],略 有改动。
1.4.2|3 -1,4-内切葡聚糖酶的提取与酶活性的测
1.4.2. 11,4-内切葡聚糖酶的提取将卩1菌株
在PDA培养基上进行纯化与扩大繁殖,25 Q下恒 温培养3d后在菌落边缘处用打孔器(1. 0cm)打下 菌片,向1.2.2中的液体诱导培养基中加5个菌片, 25 Q下振荡培养3d、4d、5d、6d、7d、8d,过滤除去 菌丝和抱子,在4 Q 8000r/min下离心15min,弃 去沉淀,留上清液,即为待测酶液。
1.4.2.2P-1,4-内切葡聚糖酶活性的测定取一 支25mL的洁净比色管,加入0. 5mL酶液,0. 5mL醋 酸一醋酸钠缓冲溶液(0.05mol/L,pH5.0), 1mL 1% 的羧甲基纤维素钠(pH 5. 0),混合均匀后迅速放入 37 〇水浴中反应30min,取出后立即放入100Q水 浴中煮沸15 min中止反应,冷却后加入1. 5 mL DNS显色剂(3, 5-二硝基水杨酸),100 Q水浴中显 色5 min,以颜色深浅程度用去离子水定容25 mL或 10mL,在722型光栅分光光度计540nm处测定反 应混合液吸光度值,根据酶反应释放的还原糖量计 算Cx的活性1101。对照:酶液先以100Q下煮沸 15min中止反应,再加入底物,其余操作同上。平行
o.O.Io.
势,在第5天时酶活性最高(表2)。
表2 Fi菌株在纤维素酶诱导培养基I中的产酶活性
培养天数(d)
345678
对照吸光度0.0570 .0730 0890. i020. i2i0. i30
反应液吸光度0.0890. i380 2530 2080. i790. i62
反应液与对照差值0.0320. 0660. i640. i060 0590 032
酶活(g/mL)75 .00i3i. 67295 00i98. 33i20. 0075 00
重复3次。
Cx的酶活单位为37 C下30min每毫升酶液催 化底物释放1〜还原糖的量(〜/mL)。
1.4.3 Fi菌株对玉米秸秆中半纤维素、纤维素和 木质素的降解能力的测定
i.4.3.i玉米秸秆固体发酵培养将分离纯化的 Fi菌株接种到液体纤维素降解酶诱导培养基I上, 25 °C振荡培养5d即得液体菌种;将液体菌种按 i0%的接种量接入玉米秸秆固体发酵培养基上, 25 C静置培养[iu]。
1.4.3.2固体发酵样品的制备和酶液的提取每 5d、10d、15d、20d取固体发酵样品,用150mL pH5. 0的醋酸一醋酸钠缓冲液浸泡3h,过滤,滤渣 于60 °C烘箱中烘干,用于测定其中的纤维素、半纤 维素和木质素的含量;滤液定容至200mL,在4°C, 8000r/min下离心i5min,弃去沉淀,留上清液,即 为待测酶液,用于测定酶活。
1.4.3.3玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的 含量测定用差重法[ii’i21测定玉米秸秆中纤维素、 半纤维素和木质素的含量。
2 结果与分析
2. i葡萄糖标准曲线
采用3, 5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖的含量。 根据测定结果,获得葡萄糖标准曲线(图i)回归方 程:y = 0. 00i2x-0. 0i3, R2= 0.9946。
°- :J[y=0.001 2x -0.013 j
〇• 25 ■R '=0.994 6
0. 05 ■
0,IIiiI1
050100150200250300
葡萄糖穴.(吒/ml.)
图1葡萄糖标准曲线
2.2 Fi菌株在2种纤維素酶诱导培养基中的产酶 活性
2.2.1 Fi菌株在纤维素酶诱导培养基I中的产酶 活性 Fi菌株在以cmc为诱导物的培养基中培养 3d、4d、5d、6d、7d、8d,提取、纯化培养液,测定Cx 酶的活性。结果表明,CMC能够诱导Cx酶的产 生,随着培养天数的增加,CMC诱导Fi菌株产生纤 维素酶的活性也发生了变化,呈先升高后降低的趋 2.2.2 Fi菌株在纤维素酶诱导培养基II中的产 酶活性 Fi菌株在以无CMC为诱导物的培养基II 中培养3d、4d、5d、6d、7d、8d提取、纯化培养液, 测定Cx酶的活性。结果表明,没有CMC的诱导, Fi菌株中几乎没有Cx酶的产生。由表3可以看 出,随着天数的增加,产生Cx酶的变化不大,而且 几乎没有酶活,表明Fi菌株需在诱导物的诱导下才 能使纤维素酶产生并具有活性。
表3 Fi菌株在纤维素酶诱导培养基II中的产酶活性
培养天数( d)
项目345678
对照吸光度0. 00i0 0020. 00i00. 00i0. 00i
反应液吸光度0 0030 0050 0030 0030 0020 003
反应液与对照差值 0 0020 0030 0020 0030. 00i0 002
酶活(g/mL)25 0026 6725 0026 6723 3425 00
由图2可知,以羧甲基纤维素钠为诱导物的培 养基中,Fi菌株产生的Cx酶随着培养时间的增加, 呈现先升高后下降的趋势。在培养5d时酶的活性 最高。此后,酶活逐渐下降,到第8天时酶活下降基 本与第3天时相同。而无羧甲基纤维素钠为诱导物 的培养基中,Fi菌株中几乎没有Cx酶的产生,而且 酶活性变化不大。
菌丝依然生长旺盛;第10天菌丝生长缓慢;第15天 菌丝大部分因基质发干而停止生长。
2.3. 2玉米秸秆基质中半纤维素、纤维素和木质素 含量变化从表4可知,用差重法测定?1菌株对玉 米秸秆中的半纤维素、纤维素和木质素的降解能力, 结果表明,三者的含量随时间的増加不断的减少,在 培养的前15d对纤维素和木质素的降解都很快,之 后对纤维素的降解速率明显降低甚至停止降解。培 养20d,对半纤维素、纤维素和木质素的累计降解速 率为3. 5%、10. 5 %、7.0%,说明在整个培养期间 Fi菌株对玉米秸秆中纤维素的降解速率最快,对木 质素的降解速率相对较慢,对半纤维素的降解速率 最慢。
表4 F,菌株对玉米秸秆中半纤维素.纤维素和
木质素的降解率(%)
项目 ■培养时间()
05101520
半纤维素含量29.528. 527.026 526 0
降解率01 02 53 03 5
纤维素含量44.541. 539 035 034. 0
降解率03. 05 59 010 5
木质素含量16.014. 011 510 09 0
降解率02. 04.56 07 0
3结论与讨论
试验结果表明,在以羧甲基纤维素钠为诱导物 的培养基中,Fi菌株能够产生Cx酶,而且在第5天 时酶活性最强。Fi菌株在玉米秸秆发酵培养基中的 生长情况良好,培养前15d, Fi菌株对纤维素和木质 素的降解都很快,之后对纤维素的降解速率明显降 低甚至停止。培养20d对半纤维素、纤维素和木质 素的累计降解速率为3.5%、10. 5%、7.0%。
本研究证实了 CMC能诱导Fi菌株产生纤维素 酶,且以第5天时酶活性最高,说明CMC是一种有 效的纤维素酶诱导剂,Fi菌株经诱导可以产生纤维 素酶来分解纤维素,这一结果与国外报道的其他 CMC促使菌种产酶的结果相一致A141。今后对纤 维素酶的作用机制以及如何提高纤维素酶的降解能 力需要做进一步的研究。
我国纤维素类资源极为丰富,但其利用率很低, 使用微生物肥料可以把这些天然纤维素物质降解为 可利用的物质(糖液、酒精、气体燃料等)有利于秸 秆还田,改善植物的营养状况,还能够抵抗某些病原 微生物的致病作用,减轻病虫害,増加产量1151。这 对解决我国乃至世界的粮食短缺、能源危机、环境污 染、病虫害防治等问题具有深远的意义。今后应进 一步加强微生物肥料的研究和开发工作,相信在不 久的将来,利用微生物肥料高效降解纤维素生产将成为现实。
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