中图分类号：^579.r〗文献标识码：A鱼类繁殖是在下丘脑-脑垂体-性腺轴（HPG轴）的控制下完成的，类固醇激素在其中起重要作用。 性类固醇激素能通过正反馈刺激性未成熟鱼的f丘脑和脑垂体分泌GnRH和G(H,启动HPG轴的功能，刺 激性腺发育11.大多数硬骨鱼类性腺发育初期分泌类固醇的能力很低，性腺对GiH不敏感，用外源类固醇 激素可加速HPG轴的启动和发育[2].性类固醇激素在鱼类性反转中起很重要的作用w .直接注射或投喂 外源性类固醇激素，会很快被代谢清除，且须反复注射或投喂，对鱼刺激大。也浪费药品。若用性类固醇激 素的缓释制剂，则可在加快鱼性腺发育的同时，减少操作次数，减轻对鱼的刺激，节约药品。这对生产足很 有意义的。
在鱼类催熟方面，微囊制剂尚无研究。本研究试图以明胶（Glaiin，GT)和羧甲基纤维素钠丨细—咖 boxyraethy celUse，CMC)研制一种廉价的含类同醇激素的微囊制剂，以达到减少操作次数、减少药品用S、 降低成本的S的。
1材料与方法1.1药品与仪器晶体辈翻了65〖<^1611：，11(；，1)(8丨§1113公司，1^)，用气流粉碎法制成微粉，90%的微粉直径小于10(^11;硫 故钠(分析纯，汕头化学试剂厂）；冰醋酸(分析纯，广州化学试剂厂）；明胶(3?^3公司）；羧甲基纤维素钠 (湖洲化工厂）；甲醛(分析纯，广州化学试剂厂）;无菌双蒸水;磁力搅拌器(上海司乐仪器厂）；分光光度计 (Phanmcia LKB Ullrospec H);冷冻干燥器（FTS,SYSTEMS, INC). i.2微囊的制备1.2.〗制备工艺用复凝聚法T艺制备。（1)将GT与CMC溶于适量的无茧双蒸水中，待完全溶解后以一 定的比例混合。（2)将类固醇激素微粉在磁力搅拌器的不断搅拌下悬浮于r/r-CMC的混合溶液中。（3)在一定温度T ,滴加10%的冰醋酸溶液至PH值为4左右，并在显微镜下观察成索情况。成赛后，加卜2倍体 枳的蒸馏水，以改善囊形。(4)冰浴冷却到20 t以下，加人与明胶等量(W/W)的甲醛，搅拌20 min. (5)加人 10%的Na〇H溶液至pH值为8 ~ 9,固化45 min. (6)用无菌双蒸水洗微囊至无甲醛（Shiff试剂检测不变 红），冷冻干燥得微囊或直接配成制剂。
1.12 i交设计为获得较高含药量和包囊率的微囊，本研究以T为囊心物，将T与明胶用量固定为1:3, 对制备工艺进行r正交设计。在反复实验的基础上，结合现有条件，确定主要考察因素及其范围为：GT浓 度 1 %、3% , CMC 浓度 0.3% ~ 0.9% , CMC 溶液：GT溶液(V/V) 1:1-〗，成囊温度 50 ~ 60 t.
将上述4个因素分为3个水平(见表丨），选择正交设汁实验表M34 )，将表1的因素和水平数值按表2 安排实验/母个实验号重复3次，测每次制备的T微爱的包囊率，越高越好。
表I因素和水平因素水;r:03CT浓度/%123CMC浓度0、30.60-9CMC溶液：CT溶液1:1!：21:3成盎温度八：505560表2正交实验表m ~一文验号ABCD囊率/%12341!(0U0.3)lO-.l)1(50)42.92id)2(0.6)2(1：2)2(55)53.23KD3(0.9)3('1：3)3(60)43.442(2)I{0.3)2(1:2)3(60)42.352(2)2(0.6}3(1:3〉1(50}51-962(2)3(0-9)1(1:1)2(55)57,113(3)1(0.3)3(1:3)2(55)52.2%3⑶2(0.6)1(1:1)3(60]68.493(3)3(0-9)2(3：2)K50)56.77\139.5137.4168.4151.57n15K3m.5152.2162.5T=1 892.4T,]77.3157.1147.5154A,46,545.836.1SO. 5A'；50,457.850.754,159.15349.1R-12.6-126.93.6由表2中《值的结果可知，影响包赛率最大的因素是G1?和CMC的浓度（11分别为12.ft和12),r；T溶液浓度在3%时较好，而CMC洛液的浓度在0.6%时较好;其次是GT溶液与CMC溶液的阼枳比，以 1:!时较佳;温度虽对包褒率的影响较小（I ? I =3.6),何不能忽视，以55 T：时较好。根据表2正交设 的结果，选择优化组合为：A3,B2, Cl,D2;由于选出的纟且合不在it交试验表中，需再进行试验，确定选出的 组合是否较优。按选出的组合进行试验，结果表明T的平均包费率为71.8%，说明所选出的组合优于K它 组合。本研究后面的实验所用微囊均是按优化后的实验方案制备的。
1.2.3微褒许射液的组成将微囊悬浮于含0.〇〇〇 5%的醋酸苯隶〈抑尚荆），0.9%的NaCl(等渗调节剂）， 0.5%的羧甲基纤维素钠(促悬剌）和0.1%的吐温-80(分散剂）的无菌双蒸水中，按要求稀释至所需含最， 分装于K5 mL离心管中备用(用于含最测定或体外释放的不加抑菌剂等附加剂），部分注射液分装后，置 100 t恒温箱中灭菌20 min.
1.3微囊的形状及粒径分布在光学昆微镜下观察微囊的形态并拍照。用校正过的带目镜测微尺的光学显微镜测微囊的囊抒大小 与分布，计数3批，每批600个微囊，取3次计数的均值。
1.4微蓦的载药霣、包裹率及回收率1.4.1含1测定方法的建立将适量T溶解在无水乙醇中，用分光光度汁在200 ~ 500 nm范围内检测(AA =1)，T的最大吸收波长在紫外光区240 nm处。精密称取T适最，用无水乙醇溶解并稀释到100 mL,分别 取1.1.25.1.5,1.75,2,2.25,2.5 mL,再分别稀释至10 mL,用分光光度计在240 nm处测定吸光度(取3 ?欠 平均值将测得的吸光度，4对相应的浓度C作图，得标准曲线。以浓度《mg/Q对吸光度，1作回归处理， 得丨 aJ 归方程：宰匪I Cf/ing/L) = 20.6A + 0.006r =0.999 9,线性范围 0.05 - 20 mg/L-】。4.2药物含t及包费率■定精密称取一定量的T,按以上方法包机后，冷冻干燥16 h ^ ,置称*瓶中 在&0<干燥器中WT-燥至恒重(24 h重量变化不超过0.2%).微囊称重后加无水乙醇25 mL,用超声波处 理]0 mm. 100 T水浴破坏丨h后，于80 T：加热提取24 h,冷却后000 g离心，将沉积的微囊再用25 mL无 水乙Sf提取，如此反复2?3次，至提取液在240 nm处无吸收峰。合并提取液，用0.8微孔滤膜过滤，fl加无水乙醇至一定体积;取滤液I mL置50 mL容量瓶中定容，用紫外分光光度计在240处测定吸光度，冉银据标准曲线计算微囊载药量及包裹率_载药最计算公式为：载药量=测得药量/微囊总重量x 100% .
为考察背景对测定是否有于扰，将不含类同醇激素的空H f:M,GCM按同样方法处埋后。加入适量的 T.再测定其含量。
I'.4.3方法回收率测定精密称取T适量，加入一系列含药量已知的微囊中，按上述含药量测定方法操 作。测回收率。每个测定重复3次，取平均值。
1.5微囊注射液的稳定性检测将TGM样品3批分别在冰箱(3~5 T)和室温（丨2?35 T：)放置，f 3,6,12,]5，18个月取样，在显微镜 下观察其形态并测定载药量。
1.6体外释药实验情密吸取T，ADSD,MT微囊注射液I mL(激索含屋皆为10 g/L),置4层厚的茶叶袋中，紧密封U后，投 入具塞的三角瓶，以30%(V/V)的乙醇50 mL为释放介质。将样品瓶放人37 ± 1 t的恒温水平震荡器（100 次/min)，以-定时间间隔取样，同时加人同体积的新鲜介质。样品在A为250 nm或245 nm处测定吸光度， 用际准曲线il'算释药景(减力空□值），共测定3批，取平均值。换算为累积释药百分率后对时间作同寸 将T,ADSD,MT的标准品装人透析袋中，同样投人盛乙醇的三角瓶，作为对照。共处理2〗rf.
1.7鱼类催熟实验1.7.1实验动物塘养日本鳗鲡分别于1999年4月及1999年12月购fj广州番禺，其中雌鳗10尾，体重范 ?50 ~ 640 g,体长范围65 ~ 84 cm.雄鳗10尾，体重范围290 ~ 480 g,体长范围54 ~ 67 cm.鱼蓄养在1 m x 0_5 mx 0,5 m的循环水族箱中，盐度3.1%?3.4%,水温丨2-25】。7.2激索处理雄绶注射微囊剂量为20B.W，雌鳗注剂量为30丨屯/g B.W,对照组注射不含类固醇激素的微表，注射间隔为25 d，共注射4次。
1.7.3注射类固醇激素微费对鳗铺性腺发育的影响鳗鲡在注射微赛后105 d,将实验组和对照绀的鱼全 合解剖，取性腺，计算GSI.
1.8数据处理数据用平均值±标准差表示，两个f■均值之间的差异用Sludail’sT检验，2个以上平均值之间的差异用 丨kmran’s新复极差法检验。尸小于0.05认为差异昆苫r表;T、），P小于0.01 T ?表示)认为差异极显着。
2结果分析2.1微囊（由优化后的工艺制备而成)的囊径与表面形态微*注射液用肉眼观察为白色乳状，光镜下TGM为边缘透明的白色球形，中间黑色的为囊心物。大多 数微囊直径在17?42^^的范围内，平均囊径为29.5 p? (平均*径计算公式：/)为平均囊径，为单个微囊的直径），能顺利通过S号针头，具有较好的通针性。
2.2载药置、包#率与回收率表3所示的是背景对明胶-羧甲基纤维素钠微嚢中睾刚回收率的影响。由表3可看出，无论背景中微 *含量是高是低，经过滤后，对T含量的测定基本不产生干扰。微弃的载药最、包濩率与回收率如表4和表 5所示。
表3不同背景对睾S回收率的彩响宁白微球M/mg类间醇加人量/邱平均实测叫 平均回收半。/ %CV/%202302?3.0 101.40.2540250248.7 99.70.4380250255.5 1CU,60.76表4微齑载药■及包裹率测定结果表5回收率试验结果S,[t pi测定次数项 a结 果I23测定次数4投药争/g0,30000.305 80.295 2样品重Ang100测得药UVg0-2]3 80.222 60.210 2含药量17.92微泰总重量/s1.21031.265 41.241 3类四醇加人镇10.0药物含量/%17,6717.5916.93平均含蚩17.4士0.41平均翔得t/mg26.87*0.48包裹率71.372,871.2平均问收率96.23 s 1.71平均包裹率/%7I.S±0.9CV/%1.822.3微蓦药物的体外释放图1所示的是微囊制剂在30%乙醇中药物逐日释放M,图2所示的是T标准品累积释放百分率。由图 可直观的看出，类固醇激素微囊化后，释放速度明显减慢，T,MT和ADSD标准品在6~ 8 h已释放90%以 上的药物，而微囊中的类固醇激素可持续释放10 d以上。微索在开始阶段释药速度都较快，存在突破效 应，这可能是吸附在微囊表面及在注射液中的类固醇激素释放引起的。在以后的时间里，微囊的每日释放 量约为330鸿，较稳定。
将释药数据分别用零级动力学、-级动力学、Higuchi方程。Hixon - CroweU立方根方程及Baker - Lons?dale 方程处理，发现微囊中睾酮的释放数据用零级动力学方程表示相关系数最好。TGM 每口释放量分别为 3.3%,释放速度较稳定，释放的tl/2分别为12.4 d.虽然微囊内药物的体外释放情况不一定代表体内释放 情况，但体外释放情况可作为体内释放的参考，并作为筛选微产制备工艺及监测微囊质量的指标。
2.4微囊注射液的稳定性T微囊放置在不同的温度后，其形态及含量的变化如表6所示。从表中可看出，未经过高温处理的微 囊无论是放置在冰箱中或是室温中，1.5 a后仍保持完好的嚢形，药物含量基本无变化，说明以GT-CMC 为囊树的微囊注射液可室温长期放置。而经过100 t灭菌处理的微索，室温放置的在9个月后开始蚀解， 12个月时已蚀解50%左右，到丨5个月已完全蚀解;经高温处理的微囊在冰箱放置时，其蚀解时间比室温 放置的晚3个月，故微囊经过100 T灭菌处理后，应放冰箱保存，并尽快使用。
表6 TCM放置在不同温度后形态及含量的变化及 J03€9121518文I 来 ?— — —冰箱#温冰筘常温0 形awMy%完%币整0.420.4217.32 ± 17.32?0.420.42完整完整完完完?€整整完T￡完完整币整m17.45±\i.n±m0.530.470.4S0.3417.46±17.54土17,39±17.37-0.610.550.470.4&M兀整兀整蚀解20% ~ 40%币蚀解\0%~完整蚀解50% ~30%80%17.1B±17.58±17.3&1\1.%±0.370.4S0.540.3917.12±17.44±0.5]0.26n,29±0.4517.16±0.58解& %解%上 蚀I90蚀90以-整-"儿整完整m0.6117.42*0.52蚀解兑全蚀解W 、 BA HA B- A BA BA BAB注A表示未经过高温处理的表示结过！00 1C处理的微典2.5亲鱼性腺发育状况雄鳗在注射含睾酮的微囊制剂后GS1为(3.7± 1.56)% ?-，较对照组(0.18 ± 0? 11)%増加，20.5倍。 实验组成熟率达到80%，而对照组无成熟的鳗鲡。由表7可看出，经过类固醇激素微囊制剂i〇5 d的处理， 雌鳗的GS1有极显着的增加。
表7雌鳗的CSI及CSI的分布(n=IO)
分组平均WGSI < 10% 的尾数10% < GSI < M 的尾数25% <GS1<40% 的尾数GSf>40%的尾数最低GSIm€S1玄验刍i U 二 10)19?± 1]"334Q4,23汨。4(n = 6)0.93 土 a?760000/341.213讨论本研究所用囊材分别为CT与CMC,都枭常用的药剂辅料，材料来源广，价格便宜。通过均匀设计与正 交设计找到了较好的制备工艺，工艺稳定，重复性好，便于工业化生产。
0.]微#形成机埋及工艺微龚的制备方法是复凝聚法，即使带相反电荷的高分子W料相互交连，溶解度降低而析出成囊。所用 #材中GT为蛋白质，分子具有较多的_\氏和一COOH及相应的离解基团一NH3"■和一C00-.所含正、负离 f的多少受pH值影响，PH值低时止离子多，而pH值高寸负离子多。CIWC是半人工合成的阴离子甩高分 子材枓，分7中有较多的一COO-,当GT与CMC共处同一溶液中时，在pH值为4?5的范围内明腔正电荷 达到最高值，与CMC结合形成凝聚物而成栽。在实验中发现，GT与CMC的浓度是影响包典平的S要因 素，因为浓度影响粘度，即影响凝聚物流动性，因此影响了包囊率。在实验屮还发现，成囊后，加人适量的蒸 馏水可改善囊形，这可能是巾于加水降低了粘度，改音了流动性，降低了界面张力，从而使囊形改善。
3.2微囊药物的体外释放微*中药物的释放机制有3种。（1)扩散，即药物由进人微囊的溶剂溶解后，经过囊膜扩散到介质中， 是物理过程。溶解在*壁或附着在微囊表面的药物扩散则形成释药的突破效应。（2)囊壁溶解，不包括酶的 作用，是物理化学过程，囊壁溶解速度取决于囊材性质、液体体枳、温度等因素。（3)囊壁的消化与降解，这 是在酶作用下的生物化学过程，囊壁被酶降解为其它代谢产物后，药物释放出来。
3.3类固_激素微囊诱导鳗鲡性腺发育的效果由结果可知，间隔25 d注射类固醇激素微囊后，可促进实验组的雄鳗精巢发育，平均GSI达3%以上。 注射类固醇激素微囊后，雌鲅性腺也有较明显的发育，平均GSI分别为19.7%.本研究中鳗睡的平均GSI 与用MT和ADSD非包膜型硅橡胶药条埋植鲮_ 7次的结果：4]相近。
在实验中发现，鳗鲡个体对激素的反应差别较大，其最高GSI与最低GSI有时相差几倍到十几倍，鳗 鲡对激素反应的差别可能与馒鲡的体质、年龄、应潋状态、性腺中激素受体的数量等因素有关。其中鱼的体 质较重要，因为鳗鲡在催熟期间不投喂，身体中的物质与能量除供应性腺发育外，还要维持基本生命活动， 因此应选体质较好的鱼来进行催熟。
笔者首次应用含类固醇激素的微囊制剂诱导鳗_性腺的发育，与以前的方法比较，将原来每15 d埋 植1次（剂量50fIg/gB.W)变为每25d注射1次（3〇ng/gB.W)，减少了对鱼的刺激，还减少激素丨f]量。微囊 制剂对雄鳗诱导效果较好，对雌鳗效果稍差。因此以后还要加强这方面的研究，如微?制剂中激素在鱼体 内的释放情况、理想的注射剂量、制备工艺对微囊催熟效果的影响及微囊制剂在其它鱼类的应爪等。
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