黄原胶发酵动力学的研究,黄原胶是由野生黄单胞菌以碳水化合物为主要 底物，经发酵产生的一种酸性胞外杂多糖[11。
黄原胶分子的基本构成为D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸w。黄原胶发酵动力学的研究,其中前三者 的比率接近3: 3: 21”。从其分子结构可以看出,主链与 纤维素基本相同，其显著差别仅在于三糖侧链在无水 葡萄糖单位之间交替出现。每两个经由P - 1，4 - D -
糖苷键连接而成的葡萄糖分子上，含有一条由一个 D-葡萄糖醛酸连接两个D-H•露糖组成的侧链，上 面连接有乙酰基和丙酮酸盐
由于黄原胶具存的独特结构141和优良性能15 61,所 以被广泛应用于多种行业中国内外针对黄原胶 研究的工作主要集中在菌种选育、培养基、发酵条件、 基因X程菌构建等诸多方面，f曰.有关发酵动力学的研 究仍少见报道，特别是国内在这一方曲未曾涉足„
发酵动力学研究发酵过程变量在活细胞的作用 下变化的规律，黄原胶发酵动力学的研究,以及各种发酵条件对这些变量变化速 度的影响。在黄原胶发酵动力学的研究中，我们主要 从两个方面进行，即菌体生长动力学和产物合成动力 学。拟通过对这两个过程中微生物比生长速率、基质 消耗率、产物合成率、维持系数等动态变量之关系以 及它们与发酵条件之间关系的研究，从而更加系统、 有效地驾驭这些发酵条件和动态变量，实现发酵过程 中的动力学问题进行了探索性研究，该项基础研究可
用于提卨我国当前黄原胶丁业化生产过程的控制 水平；为改善我国生产的现有黄原胶质量提供了T.程 动力学的调控依据。同时，也为我们后续的基因工程 的黄原胶生物合成代谢谱图及生产工艺放大的研究 奠定了理论基础。
1材料与方法
1.1材料 1. 1.1菌种
Xanthonomas campestris一9002,由本研究室保藏 菌种选育 1.1.2培养基
1.1.2. 1斜面培养基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,牛肉膏0.15,酵母浸出物
0.3.琼脂2.0,pH7.0。
1.1.2.2种子培养基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母浸出物0.3,牛肉膏
0.3,硫酸镁0.01,磷酸氢二钾0.05,碳酸钠0.2, PH7,0:
1. 1.2.3发酵培养基(％)
葡萄糖1.0,淀粉3.0,蛋白胨0.3,酵母浸出物 0. 3，氯化钾0. 5,磷酸氢二钾0. 41,硫酸镁0.01,磷酸 二氢钾 0.069,抒檬酸 0.2,PH7.03 1.2方法
1.2.1摇瓶发酵试验
按常规细菌学方法制备种子菌液，以10%的体积 比接人发酵培养基中，并将发酵培养基的最终体积控 制在100ml,装人500ml的二角瓶中，置往复式摇床， 发酵6011(23〇1?111,28尤）(：每个样品设三个重复。 1.2.2发酵罐发酵试验
种子液制备同摇瓶发酵试验。装液量5000ml,接 种量10%,通气量0.6L/min，转速250/min,温度 28 ~3(«：,发酵周期60h,取样间隔4h,PH7.0。检测参 数:转速、温度、粘度、残糖、pH和产胶率3 1.2.3恒化培养
培养基配方同分批培养。恒化培养开始前，先进 行分批培养。培养基经接种后让菌体生长繁殖到一定 的浓度，发酵液粘度达到lOOOOcps以上时，开启蠕动 泵，以某一恒定速率补料，并连续流出样液，保持发酵 罐内液面恒定：当达到稳定状态时，测定各状态参数, 调大流速进行下一组试验。培养条件:28 ± 1^ ,35〇" min,通气量 0. 6L/minn
恒化培养试验装置如图2所示。试验通过进料口
处的两只蠕动泵来调控补料流量，连续从取料n取 料，以维持罐内发酵液体积为一恒定值。
1.2.4发酵液PH值的测定
用PHs -25型PH计直接测定发酵液的pH值。
1.2.5发酵液残糖的半定置测定
产）
1.2.6发酵液粘度的测定
取发酵液直接用上海天平仪器厂生产的- I 型旋转粘度计以叫号转了• 6r/min测定，ffl所得数据 乘以1000即为发酵液粘度5 1.2.7发酵液吸光度的测定
取发酵液稀释后直接用72〖型分光光度计在 650nm波长下测定其吸光度。
1.2,8产胶率的测定
定量称取发酵液，下业酒精沉降.50T烘至恒 1。称最干胶重量，黄原胶发酵动力学的研究,干胶重1与发酵液重量的比即为 产胶率。
1,2,9发酵液残糖的定量测定(3,5—二硝基水杨酸 比色定搪法)丨18]
1,2.10细胞干重的测定
定量吸取发酵液，适当稀释后用事先烘干的滤纸 在大漏斗中过滤，将滤纸置于50〜烘箱中烘至恒 重，称重后换算成所需单位。
2结果与讨论
2.1黄原胶分批发酵特性 2.1.1菌体生长曲线
图3为黄原胶分批发酵过程中发酵液吸光度随 时间的变化规律，发酵液吸光度的变化可看作是其中 菌体量的变化，故吸光度随时间的变化曲线可看作菌 体生长曲线，体现发酵过程中菌体的生长情况。从生 长曲线来看，菌体的对数增长期为发酵开始12至 20h，在这一时间内，菌体生长速度最快jOh以后进人
发酵时间[h)
®4黄原胶发酵过程中PH的变化曲线
稳定期，曲线呈平缓趋势,菌体生长儿乎停止。20h后表1。 达到稳定期是因为培养液中菌体繁殖达到平衡。
2.1.2 pH的变化
图4为黄原胶分批发酵过程中pH随发酵时间的 变化曲线3从曲线可看出，在发酵的初始阶段PH值有 一较小的上升，这是因为发酵液中的一些金属盐类及 酸根离子所具有的缓冲作用。之后，因产物合成产酸， pH下降，直至稳定期开始，菌体生长缓慢，pH儿乎不 再发生变化。
于新鲜培养基的加人造成局部浓度现象的发生=发酵 罐的工作体积确定为8L(其装量系数为〇. 625)「综合 工艺要求，选择搅拌转速为35〇r/min，培养温度为 通气童〇. ^L/min。连续培养补料葡萄糖溶 液浓度为30g/L„
2.3恒化培养稳定状态的确定
根据发酵液粘度及pH的变化进行判断，当粘度 和pH在一较长时间内维持稳定时，间隔〗~ 2h取样 测其粘度，并观察pH变化，若2 - 3次无变化或变化 很小，即认为系统已达稳定状态。
2. 4连续培养试验结果
按上述实验条件和要求，以葡萄搪作为限制性基 质进行连续培养先进行分批培养，并在24h以相对 于发酵液1%的量补加葡萄糖一次。当发酵液粘度升 至]8500cps时开始连续培养。稀释率试验范围为 0.03-0. 08h_\当每改变一次稀释率，进人稳态后分 别取样测定残糖、菌浓、粘度和产胶率。试验结果列于
由表1可见，菌浓、产率、粘度、pH均随稀释率增 大而降低。这是因为发酵液浓度变稀所致。不同稀释 率下的各参数计算值见表
表1恒化培养试验数据
稀释速率D/(f)菌浓(g/L)残糖(g/L)粘度{cps)pH产率(％)
0.0335.27. 830139006.352.36
0.0432.611.1188006,051.54
0- 0530.214.7053005.901.46
0.0627,019-0138005.861-22
a 〇819.831.2535005-911.12
表2不同稀释速率下各参数的计算值
rnh-1)Yc(g/g)DX(g/L h)Qo^g/g. h)
0.030. 02741.0941.06a 0020
0,040. 0354L 1281.300.0021
0.050.04191. 1941.510.0024
0.060. 04661,2861.620. 0027
0.080.03542. 2631.580. 0045
其中；Qr. = D(S。- S)/X为底物葡萄糖比消耗速率.g/f；. h; Yc =- S),为基质得率系数,以以D/X,为黄质K比生成速
率j/g；. h;DX为菌沣生长速軋g/L上
2.2培养条件的确定所致。
恒化培养要求发酵罐内培养液混合均匀，防止由2.5—9902生长模型的建立
由表2可知，随着稀释率的增加，基质得率和 产物比生成速率都呈上升趋势，黄原胶发酵动力学的研究,这说明连续补料可 提高基质得率，促进产物生成。而底物比消耗速率 和菌体生长速率均增加到一定程度后有所下降，这 是由于体系被稀释一定程度后菌体生长平衡被打破
0 111''
0.030.040.050.060.08
稀释率(1/h)
+残.+茴浓+产率一•_粘度
图，不同玀释速率T的稳态蒗浓、产胶率、残糖、粘度
及发酵动力学特性参数的推导
图5显示野油菜黄单胞菌连续培养达稳态时菌 体浓度、黄原胶产率、发酵液粘度、残糖含量随稀 释速率D的变化关系，从图中可以看出，随D的提 高，菌体浓度、发酵液粘度和产率均下降。由于葡 萄糖料液流人体系后有三个流向，一为菌体生长消 耗，二为产物合成消耗，其余随发酵液流出。故葡 萄糖料液的不断补加使体系稀释，上述参数下降， 残糖含量增加。
已知 Monod 方程S/(fe+S)⑴
变形得 1/(1 = 1/和„ + Ks/p™,. 1/S⑵
稳态时P = D,故l/)x可以1/D来代替。
由图2-4可见l/>ftl/S成直线关系，说明野 油菜黄单胞菌的生长与限制性基质浓度的关系符合 Mum>d方程。根据连续培养试验结果，用计算机对1/ M•和i/s进行最小二乘回归，求得jw=o. ism-1, L = 41. 32g/L(其相关系数 R = 0. 9995)。
在连续培养中，对底物葡萄糖进行物料衡算，可 以得到基质的比消耗速率与菌的比生长速率^最 大生长得率系数Yc™'和维持系数m的关系式如下：
Q& = II/YG0"1 + tn(3)
拫据式(3),通过计算机对和p进行线性回归 |由于稀释率为a 〇8时体系已被破坏，故作图时舍去 该点），求得 YGm!U = 1. 560g/g 和 m = 0. 009g。
2.6服咖,? c£iwi/)€sfris—9902 比生长速率对菌
体产率的影响
由Mnnod方程变形得3口皡,,/(卜-^)(4)
因「) = [1，所以 S = DKV(p^-D)(5)
g0.5 .
〇11111
00.020.040.060.089,1
K-ll/h).
囝7比生长速率叫与菌体产串DX的关系
稳态时，对限制性养分葡萄糖进行物料平衡可求
得
X = Y(SU-S)(6)
将式5代人式6得
X = YX/5[S〇-DK5/(JI„„-D)](7)
故
DX=DY1/5|S〇-DK5/((j..„-D)l(S!
为求得DX达到最大值时的D
d(DX)/dD=0(9)
解方程(8)和(9),并假设Y.x/S不受D的影响，则 D = D. = )L.„[I - (K./fKs + So))1'-'](10)
将（!■_=0. 18901T1，K,=4].32s/I.，S〇=40g/L 代人式(10)得最适理论稀释速率D„ = 0. 05428h -1。
图7为DX随A而变化的曲线，曲线呈钟罩形，由 计算所得最佳理论稀释速率与曲线峰值逼近，黄原胶发酵动力学的研究,说明理 论值与试验结果相符3曲线与横坐标D为0时的交点 0. 1684和计算所得最大比生长速率0. ]890较为接 近，进一步证明了试验的正确性
3结论
通过对黄原胶发酵动力学的研究.得知分批发 酵过程中菌体对数增长期为12~20h PH随发酵时 间先小幅度增加，后下降，对数增长期后平缓。1/|X 与1/S符合Momjd方程，得出最大比牛长速率 (x„„=0. I890h'饱和常数K.=4〖.32g/L,基质得
率系数二〇, 〇62g/g，维持系数m = 0」543g/ g,h,最佳理论稀释速率Dtn=0,0M28h_1。随稀释 速率增加，粘度、菌浓、产胶率下降，残糖上升。
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