黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻：
黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，寡糖因其独特的生物学活性而引起了国际上众多研宄者的极大兴趣。黄原 胶是人类研宄最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖，而 关于其降解产物一一黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性，至今未见报道。
本文通过酶解方法成功地制备了黄原胶寡糖，并应用HPAEC-PAD以及 MALDI-TOF-MS对酶解产物的组成、结构进行了初步分析，此外，还第一次 对黄原胶寡糖的生物学活性进行了探索。
本文从野外筛选到了一株能够分泌黄原胶降解酶的菌株，并对该菌株进行 了初步鉴定，确定为属中的一个新种；初步分离纯化了黄原胶降 解酶，并对该酶的酶学性质进行了研宄;通过HPAEC-PAD以及MALDI-TOF-MS 对黄原胶酶解的产物进行了组成、结构分析，确定了酶解的主要产物为五糖单 元，并确定了酶解位点。
对黄原胶寡糖在抑菌、抗病毒、植物诱抗、抗氧化方面的生物学活性进行 了探索，发现黄原胶寡糖拥有较强的抑制真菌生长的能力，而对细菌则没有抑 制作用；黄原胶寡糖还拥有了很强的抗病毒活性，一定的植物诱抗活性以及较 强的抗氧化活性。
许多微生物都分泌胞外多糖，它们或附着在细胞表面，或以不定型粘质的 形式存在于胞外介质中，这些胞外多糖对于生物体间信号传递、分子识别、保 护己体免受攻击、构造舒适的体外环境等方面都发挥着重要的作用。
这些分泌的多糖结构各异，其中一些有着优良的理化性质，已为人类广泛 应用。对于仍不为人类所知的绝大多数多糖，人们试图通过相关的多糖结构间 的相互比较，推断出构效关系，从而人为地主动修饰、构造多糖，以满足应用 的需要。
其中，黄原胶是人类研宄最为透彻、商业化应用程度最高的一种。
1.1黄原胶的结构
黄原胶(xanthan gum)于二十世纪五十年代由美国农业部的北方研宄室(Northern Regional Research Laboratories, NRRL),由野油菜黄单孢菌从owowos1 cawpe^r^，NRRLB~1459)分泌的中性水溶性多糖，又称为汉生胶。
黄原胶由五糖单位重复构成，如图1,主链与纤维素相同，即由以0-1，4 糖苷键相连的葡萄糖构成，三个相连的单糖组成其侧链：甘露糖一葡萄糖一甘 露糖。与主链相连的甘露糖通常由乙酰基修饰，侧链末端的甘露糖与丙酮酸发 生缩醛反应从而被修饰，而中间的葡萄糖则被氧化为葡萄糖醛酸，分子量一般 在办106〜2x107Da之间。
黄原胶除拥有规则的一级结构外，还拥有二级结构，经X-射线衍射和电子 显微镜测定，黄原胶分子间靠氢键作用而形成规则的螺旋结构。双螺旋结构之 间依靠微弱的作用力而形成网状立体结构，这是黄原胶的三级结构，它在水溶 液中以液晶形式存在[1]。
1.2黄原胶的性质
黄原胶的外观为淡褐黄色粉末状固体，亲水性很强，没有任何的毒副作用， 美国FDA于1969年批准可将其作为不限量的食品添加剂，1980年，欧洲经济共 同体也批准将其作为食品乳化剂和稳定剂[2]。
由其二级结构决定，黄原胶具有很强的耐酸、碱、盐、热等特性。黄原胶最 显著的特性是其控制液体流变性质的能力，它即便在低浓度时也可形成高粘度 的、典型的非牛顿溶液，具有明显的假塑性(即随着剪切速率的增大，其表观粘 度迅速降低）。溶液粘度的影响因素还包括溶质浓度、温度（既包括黄原胶的溶 解温度，又包括测量时的溶液温度）、盐浓度、pH值等，现分别简述之。
1.2.1温度的影响
黄原胶溶液的粘度既受测量时溶液温度的影响，也受溶解温度的影响。
Fig. 2-a Influence of temperature (TM)Fig. 2-b Effect of dissolution temperatureon xanthan
solution viscosity(TD) on xanthan solution viscosity.
像大多数溶液一样，黄原胶溶液的粘度随溶液的温度（TM)的升高而降低， 且此变化过程在1〇°C〜80°C完全可逆，如图2-a所示：
由于黄原胶在其水溶液中存在两种构象：螺旋型和不定型。随溶解时的温 度(TD)升高从螺旋型向不定型转变，改变了其聚合物的胶连方式和程度，从而使 溶液粘度发生改变。粘度随TD改变的曲线如图2-b所示。此变化曲线折为三段， 低于40C时随TD增加粘度减小，在40C〜60C时，粘度随TD升高而增大，当 TD大于60C时，粘度随TD的变化趋势又变为随温度升高而减小[1]，[3]，[4]。
1.2.2盐浓度的影响
盐浓度对黄原胶溶液的粘度有一定影响。在浓度较低时，少量盐的加入可 使粘度略微下降，这主要是由分子间电荷力的降低造成的；在黄原胶浓度较高 时，加入大量的盐可使溶液粘度增加，这可能是由于增加了分子间的胶连程度[5]; 而当盐浓度超过〇.1%(W/V)时，盐浓度对溶液粘度没有影响[6]。
多价金属盐在不同pH值范围内可与黄原胶形成凝胶，如钙、镁盐形成凝胶 的pH值为11〜13，三价金属盐在较低pH值时即可形成凝胶或沉淀[5]。
1.2.3 pH值影响
相比较而言，黄原胶溶液的粘度受pH值影响很小。pH>9时，侧链上的乙 酰基脱掉，在pH<3时，丙酮酸和乙酰基开始脱掉。据研宄者指出，脱除丙酮酸 和乙酰基后的黄原胶与野生型的黄原胶对溶液的粘度影响几乎相同[7]。
1.2.4剪切力的影响
黄原胶溶液有着突出的假塑性，溶液粘度随剪切力的改变而变化，且该变 化在很大的程度上可逆。许多研宄者都对黄原胶溶液的粘度随剪切力的变化模 型提出了方程。
用Ostwald de Wale方程解释模型，得到：叫=K?n-1
其中&是表观粘度，？是剪切率，K是恒定系数（即在剪切率为1S-1时的粘 度数值)，n是流体系数，对假塑性流体而言，n<1[8]-[9]。
另外，还有人提出用Casson模型来描述这一特性：tQ.5=t〇+K屮a0.5 与前一个方程相比，这一方程考虑了最初的剪切力t。，另外的一个参数Kc 是Casson常数，t是剪切力，叫是表观粘度[3]，[10]。
在剪切速率在0.39〜79.2 S-1间时，这两个方程与实验数据都可很好的吻合， 在超出此范围时则需查相关文献来重新确定方程。
1.2.5黄原胶浓度的影响
随着黄原胶在溶液中浓度的增大，其分子间作用及胶连程度增加，从而使 粘度增加，但不完全成比例[5]。如下图3所示：
图3浓度对溶液粘度的影响图4黄原胶与其他多糖的同促作用
Fig. 3 Influence of xanthan concentration Fig.4 Viscosity of various pure and mixed on solution on viscositybiopolymers.
1.2.6同促作用
黄原胶的另外一个显著的特征是其与半乳甘露聚糖的同促作用，如槐豆胶 (Locust bean gum)、瓜尔胶(Guar gum)等。即当黄原胶与半乳甘露聚糖混合时，
其混合物粘度较之其中任何一种单独存在时，粘度都明显增加[6U11H14]，如图4
示。
混合溶液的粘度与这两种溶质的构象相关，前已述及，黄原胶在溶液中的
构象依溶解温度而定。当黄原胶在较低温度（<40°C)溶解时，呈规则的螺旋构 象，与不规则构象相比，与半乳甘露聚糖间的胶连作用更强。而半乳甘露聚糖 溶液的性质同样也受溶解温度的影响，该聚糖主链由甘露糖连接而成，上面连 有单糖分子的半乳糖构成侧链，侧链在主链上的分布并不均匀，没有侧链区域
称为光滑区（smooth regions )，侧链分布均匀的区域称为毛发区（hairy regions )，
毛发区与黄原胶的作用很小。但光滑区部分仅在80C左右溶解[15]，因此，欲得 到较强同促作用的黄原胶与半乳糖苷聚糖的混合物，应使黄原胶在较低温度下 (<40°C)溶解，使半乳糖在较高温度下（80C左右）溶解，然后将两者混和。
黄原胶与各种酸碱都有很好的相溶性，且性质稳定，还可与甲醇、乙醇、 异丙醇以及丙酮互溶，但溶剂超过50%〜60%时则可引发沉淀。黄原胶不溶于多 数有机溶剂，但在25C下可溶于甲醛，在65C下可溶于甘油和乙二醇。
近年来又相继报道了由野油菜黄单孢菌的突变菌株分泌由重复的四糖单位 (侧链由二糖构成，图5-1)和三糖单位（侧链为单糖，图5-2)组成的黄原胶， 结构如下：
(-►4Glcpl —► 4Glcpl—►)
图5-2突变后的黄原胶 Fig. 5-2 Modified Xanthan
GlcAp
图5-1突变后的黄原胶 Fig.5-1 Modified Xanthan
Ac-6Mana
与野生型黄原胶相比，由重复的四糖单位组成的聚糖（图5-1)使溶液粘度 增加的作用很弱，因而不宜用于增稠剂；而由重复的三糖单位（图5-2)组成的 聚糖在相同质量下使溶液粘度增大的能力要大于野生型黄原胶[16]。
1.3黄原胶的生产
黄原胶的生产工艺经过半个世纪的发展精琢，现已较为成熟。底物转化率 达60%〜70%，以至国外的一些杂志称其为“基准产品”，将其他发酵产品的产率 与之对比定位。'
分泌黄原胶的菌株一一野油菜黄单孢菌是甘蓝、紫花苜蓿等一大批植物的 致病菌株，直杆状，宽0.4〜0.7ym，有单个鞭毛，可移动，革兰氏阴性，好氧。
有研宄者已发现了合成、装配黄原胶所需的数种酶，克隆出相关基因（十 二个基因的联合作用），并据此提出了黄原胶在菌内的合成途径[17]。黄原胶的生 产受到培养基组成、培养条件（温度，pH值，溶氧量等)、反应器类型、操作方 式（连续式或间歇式）等多方面因素的影响。常用的培养基是YM培养基以及 YM-T培养基，两种培养基得到的产量相似，但应用YM-T培养基的生长曲线有 明显的二次生长现象。菌株可在25〜30°C下生长，最适的发酵温度为28°C，已 有研宄者提出具体的温度与生长速率关系的方程[18], [19]。
图6黄原胶生产流程概图 Fig.6 Outline of the xanthan gum production process.
图6为黄原胶生产工艺简图。
由于分泌出的黄原胶包裹在细胞的周围，妨碍了营养物质的运输，影响了 菌种的生长，因此，接种阶段时除应增加细胞的浓度外，还应尽量降低黄原胶 的产量，这样就需多步接种（每步接种时间必须控制在七小时以下，以免黄原 胶生成），接种体积一般为反应器中料液体积的5%〜10%，接种的次数应随发酵 液体积增大而增多[20]。
发酵液中的成分配比也是影响产量的重要因素。碳源（一般为葡萄糖或蔗 糖）的最佳浓度为2%〜4%,过大或过小都会降低黄原胶的产量；氮源的形式既 可以是有机化合物，也可以为无机化合物。根据经验，较为理想的营养成分配 比为：
蔗糖（40g/L),拊蒙酸（2.1g/L)，NH4NO3 (1.144g/L)，KH2P〇4 (2.866g/L)， MgCk (0.507g/L)，Na2S〇4 (89mg/L)，H3BO3 (6mg/L)，ZnO (6mg/L)，FeC^ ?6压0 (20mg/L)，CaC〇3 (20mg/L)，浓 HCl(0.13ml/L)，通过添加氢氧化钠 而将pH值调为7.0[21]。
发酵温度不仅影响黄原胶的产率，还能改变产品的结构组成。研宄指出， 较高的温度可提高黄原胶的产量，但降低了产品中丙酮酸的含量[22]，因此，如 需提高黄原胶产量，应选择温度在31°C〜33°C，而要增加丙酮酸含量就应选择 温度范围在27°C〜31°C[23]。
pH范围在中性时最适于黄原胶的生产，随着产品的产出，酸性基团增多， pH值降至5左右。研宄表明控制反应中的pH值对菌体生长有利，但对黄原胶的 生产没有显著影响[24]。
反应器的类型及通氧速率、搅拌速率等都有相应的经验数据，须根据具体 条件而定。可参考如下数据：搅拌速率在200〜300rpm，空气流速为1L/L，min。
除上述传统发酵的生产方法外，人们还克隆出产生黄原胶的基因，并选择 出适当的载体，虽然目前此法的成本较高，但相信经过工艺的改进，可为进一 步降低成本及控制产品的结构提供可能。
黄原胶的提取
相比较而言，从发酵液中回收产品的成本较高。一般的，最终发酵液中的 组分为：黄原胶：10〜30g/L，细胞：1〜10g/L，残余营养物质3〜10g/L，以及 其他代谢物。由于高浓度的黄原胶的存在，溶液浓度很大，从而增加了提取操 作的困难，因此，宜先做稀释处理。
提取的主要步骤：细胞的沉淀，黄原胶的沉淀、脱水、干燥、研磨。
目前有多种方法可灭活发酵液中的菌体。酶法成本较高；化学试剂容易改 变pH值，而降低产品中的丙酮酸含量；因此一般采取巴氏灭菌法，此法由于温 度较高还可提高黄原胶的溶解度，并在一定程度上降低了溶液的粘度，利于随 后的离心或过滤。但要注意温度不能过高，使其发生降解，一般维持在80°C〜 130°C，加热10〜20min，pH值控制在6.3〜6.9。过滤前需要稀释，稀释剂一般 为水、酒精或含低浓度盐的酒精，下面将可以看到由酒精作为稀释剂会对后面 的工艺有所帮助。沉淀黄原胶的方法有加盐、加入可溶于水的有机溶剂（如乙 醇、异丙基乙醇<IPG>等），或将这两种方法综合运用。
加入有机溶剂不仅可降低溶液粘度和增加黄原胶的溶解度，还可洗脱杂质 (如盐、细胞、有色组分等），但单独加有机试剂所需量太大，成本过高。如要 全部沉淀每体积发酵液中的黄原胶，需三倍体积的丙酮或IPG，六倍体积的乙醇。 加入盐离子可降低黄原胶的极性从而降低其水溶性，且加入盐的离子强度越高 效果越明显，如Ca2+，Al3+等，加入Na+则不会引起沉淀。因而，加入含低盐浓度 的有机试剂是目前较为通用的方法[25]，如加入1g/L的NaCl可使乙醇的使用量 减半；加入二价离子虽可使有机试剂的使用量更小，但使得产物一一黄原胶盐 一一的溶解度降低，因此一般不采用。
下面的图分别为黄原胶溶液加入无盐的有机溶剂以及含不同量的NaCl的 IPG的沉淀曲线：
图7-1单独使用有机溶剂时黄原胶的沉淀曲图7-2无机盐和有机溶剂共同作用时黄原 线胶的沉淀曲线（无机盐含量：1g/L)
Fig.7-1 Xanthan precipitation using organic Fig.7-2 Xanthan precipitation using mixtures of solvents without salt.IPA with 1 g/ L of salts
1997年曾有人报道用超滤法来提取黄原胶，但未得到广泛应用[26]。
沉淀滤出后的工艺为脱水、干燥、研磨、封装等，研磨时必须注意不得过 热，封装时则需注意防潮。
而必须注意的是，具体的提取工艺与产品的应用范围有关，如用于采油， 则需除去微粒（如细胞体）以免阻塞孔道，食品级的黄原胶则需脱除所有的菌 体和杂质，如应用于纺织业等则要求要相对宽松的多。
1.5黄原胶的降解
驱使人们研宄黄原胶降解途径动力主要有三个：
工业应用上的方便
黄原胶超乎寻常的稳定性本身也是一把双刃剑：一方面，它大大地增加了 其应用普及度；另一方面，它也产生了一些问题。比如在采油业中，由于使用 黄原胶而增加了溶液的粘度，从而大大增加了后续工艺如油料运输及产品纯化 的成本。唯有可方便地将其降解才可使得对黄原胶的应用做到“进可攻，退可 守”
2〇黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
关于其构效关系的信息
将侧链上的单糖逐个剥离，研宄其性质，并与野生型相比较，从而可得到关 于功能的关键组成位点的信息。
可能拥有特殊生物活性的寡糖产品
由于寡糖在无毒害、抗病毒[27]、抑菌[28]、利于肠道双岐杆菌增殖[29]、植物 诱抗[30]、提高免疫力[31]等方面有着神奇的功效，因而造就了目前寡糖工程在国 际上竞相研宄、炙手可热的局面。由植物致病菌分泌的黄原胶所降解的寡糖是 否也拥有某种生物活性的疑问也激起了人们强烈的兴趣。
尽管黄原胶的主链与纤维素相同，但由于规则的螺旋结构的保护，以及侧 链所产生的位阻，使得一般的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶等都很 难将其降解。多糖的降解，通常可用酸（如盐酸、次氯酸）或强氧化剂（如过 硼酸钠、过硫酸铵），尽管这在实验室效果不错，但在实际应用中，存在环境问 题的同时，效果也不理想。
1980年，M.Rinaudo等人第一次报道用一种纤维素酶对处于不规则构象的 黄原胶主链进行随机降解，然而，对于一般规则的螺旋构象的黄原胶而言，该 酶几乎没有降解作用。随后，1981年，Cripps等人的研宄小组发现了一种能以 黄原胶为唯一碳源生长的土壤棒状杆菌，命名为NCIB11535。用薄层层析分析 其降解产品，降解产物有九种，而对于脱乙酰的黄原胶而言，降解产物只有四 种，分别是甘露糖，甘露糖与丙酮酸的缩酮产物，以及两种寡糖产品（专利 WO0030393)。
很多情况下，黄原胶降解酶工作的环境非常恶劣，如高温、高盐等，因此 对酶的要求也相当苛刻。1982年，M.C.Cadmus发现了一种耐盐的黄原胶降解酶 (专利US4410625)，此酶可在NaCl浓度在4〜10°%，48°C时仍保持一定的活性。 此后陆续发现了数种降解酶，如专利：US4690891, US4996153, US6110875, WO9839379 等。
从黄原胶的结构推断，应该有两种酶在降解过程中起作用：主链降解酶 (Xanthanase)以及侧链降解酶（Xanthan lyase)。实际应用中，降低粘度时主要 依靠前者，但后者对于进一步了解结构与功能的关系也非常必要。
1.6黄原胶的应用
黄原胶由于其独特的剪切稀释性质，良好的增稠性，理想的乳化稳定性， 对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性，以及对人体的完全无毒害等许多优良 的特性，因而在食品、石油、医药、日用化工等十几个领域有着极其广泛的应 用，其商品化程度之高，应用范围之广，令其他任何一种微生物多糖都望尘莫 及。现略举一二。
.食品方面
许多食品中都添加黄原胶作为稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂和加工辅 助剂。黄原胶可控制产品的流变性、结构、风味及外观形态，其假塑性又可保 证良好的口感，因此被广泛应用于色拉调料、面包、奶制品、冷冻食品、饮料、 调味品、酿造、糖果、糕点、汤料和罐头食品中。近年来，较发达国家的人们 往往担心食品中的热值过高而使自己发胖，黄原胶由于其不可被人体直接降解 而打消了人们的这一顾虑。此外，据1985年日本的报道，对十一种食品添加剂 进行对比测试，黄原胶是其中最为有效的抗癌试剂。
日用化工方面
黄原胶分子中含有大量的亲水基团，是一种良好的表面活性物质，并具有 抗氧化、防止皮肤衰老等功效，因此，几乎绝大多数高档化妆品中都将黄原胶 作为其主要功能成分。此外，黄原胶还可作为牙膏的成分实质增稠定型，降低 牙齿表面磨损。
医学方面
黄原胶是目前国际上炙手可热的微胶囊药物囊材中的功能组分，在控制药 物缓释方面发挥重要作用；由于其自身的强亲水性和保水性，还有许多具体医疗
12黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
操作方面的应用，如可形成致密水膜，从而避免皮肤感染；减轻病人放射治疗 后的口渴等。此外，李信、许雷曾撰文指出，黄原胶本身对小鼠的体液免疫功能 具有明显的增强作用[32]。
工农业方面的应用
在石油工业中，由于其强假塑性，低浓度的黄原胶(0.5%)水溶液就可保持钻 井液的粘度并控制其流变性能，因而在高速转动的钻头部位粘度极小，节省了 动力；而在相对静止的钻孔部位却保持高粘度，从而防止井壁坍塌。并且由于 其优良的抗盐性和耐热性，因而广泛应用于海洋、高盐层区等特殊环境下的钻 井，并可用作采油驱油剂，减少死油区，提高采油率。
黄原胶用于造纸工业可降低纸浆絮凝现象，使纸张成型均匀；在纺织印染 业中用作增粘剂、上胶剂、稳定剂、上光剂和分散剂；在陶瓷工业中用作增稠 剂及上釉润滑增色剂。
利用黄原胶的耐热性和低浓度高增粘性而制成的凝胶型抗溶泡沫灭火剂是 消防业的重大突破，被称为万能泡沫灭火剂（可灭极性溶剂火）。
黄原胶还能用做除莠剂、灭虫剂、肥料等的悬浮剂，喷洒时能控制药物的 漂流和黏附，延长有效期，也可做良好的稳定剂。此外，黄原胶还可用于抗氧化 剂、催化剂载体等，鉴于黄原胶应用过于宽泛，以上仅是管中窥豹。
人们对黄原胶的发现以及随后对其结构功能进行的大量研宄,触发了人类对 微生物多糖优良的性质的强烈好奇，引发了发酵史上不小的轰动。迄今半个世 纪已过，人们依然没有降低对黄原胶的研宄热情（据估计，全世界对黄原胶的 需求量每年以7%〜8%的速度增长，仅从世界石油组织分析结果显示，近期世界 石油行业钻井和三次采油方面需要黄原胶将达90万吨/年〜100万吨/年），相信随 着研宄的进一步深入以及生产工艺的进一步改进，黄原胶应用潜力仍然很大。
如蕴涵于一切事物中的辩证性（或曰对抗性）因素那样，这几种方法各有 利弊。物理方法简单易行，但适用范围较窄，仅局限于结构性质不甚稳定的多 糖；化学方法的普适性较强，操作也相对简单，但一般而言，降解产物组成复 杂，副产物多，难于后续加工处理，且容易造成环境污染；酶解以其效率高， 产物结构相对单一，易于分离纯化，有较高的操作重复性，污染小等优点从而 成为生化工作者的首选，但其最大的障碍便是难以获得高降解效率的酶源，此 外，酶解的操作条件也相对苛刻（如严格的pH、温度操作范围等）。
对于黄原胶而言，如前所述，其结构非常稳定，因此物理方法降解并不适 用。因此备选方案就剩下化学方法及生物学方法。
1980年，M.Rinaudo等人第一次报道用一种纤维素酶对处于不规则构象的 黄原胶主链进行随机降解，然而，对于一般规则的螺旋构象的黄原胶而言，该 酶几乎没有降解作用。原因可能是由于处于不规则构象的黄原胶分子缺少了稳 定的双螺旋结构的保护，因此更易受攻击。
因此，在制备黄原胶寡糖方法的摸索阶段，本章实验所用的黄原胶溶液皆 在80°C下溶解，以期获得更容易降解的处于不规则则构象的黄原胶分子。
由于黄原胶溶液的粘度很大，因此可用目测的底物溶液（黄原胶）粘度的 是否大幅降低来表征其是否被降解。
化学方法探索黄原胶的降解
酸解：
试剂：HC1、H2SO4皆为市售分析纯 实验方法：
分别在50ml 1%黄原胶溶液中加入2M的HCL、H2SO4、CH3COOHIO ml，
于80°C水浴下磁力搅拌。
喊解：
试剂：NaOH为市售分析纯 实验方法：
在50ml1%黄原胶溶液中加入NaOH 3g,于80C水浴下磁力搅拌。
强氧化剂降解：
试剂：H2O2, KMnO4, (NHO2S2O4、NaIO4皆为市售分析纯 实验方法：
分别在50ml1%黄原胶溶液中加入30ml H2O2 (30%)、KMnO44g, (NH〇2S2O45g，NaIO42g，于遮光处，室温下磁力搅拌。
结果及讨论：
HCl以及H2SO4在80C下都可以水解黄原胶，致使其溶液粘度明显变小。 CH3COOH由于其酸性较弱而不能水解黄原胶。
NaOH加入黄原胶溶液中后溶液便成了韧性很强的凝胶，不能水解黄原胶。 (3 ) KMnO4以及NaIO4可以水解黄原胶，致使其溶液粘度明显变小。
H2O2以及(NHO2S2O4无法水解黄原胶。
18黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
2.2黄原胶降解产物的组成分析
用薄层层析初步分析黄原胶的降解产物 实验方法：
展开剂：正丁醇：乙醇：水=10: 1: 2 (V/V)
显色剂：A: 16% AgN〇3溶液：丙酮=1: 9 (V/V)
B: 1% NaOH 乙醇溶液（W/V)
C： 6 mol/L NH3 H2O
在层析缸中双向展开后，喷上显色剂后120°C下烘烤10min显色。
结果及讨论：
薄层层析的结果显示，降解的产物大多为单糖，可能降解条件过于剧烈。（由 于意外而未将结果保存）
如需得到需要的寡糖片段，则需要进一步摸索降解条件（如时间、温度等)， 而即便如此，也很有可能得非所需，由于这原本就是非专一性的剧烈反应。宜 选取更为温和的重复性更好的降解方法。
2-3酶解方法探索黄原胶的降解
选取了实验室中现有的几种生物大分子降解酶作为实验对象。
主要实验仪器：恒温水浴槽，夹套反应器 主要试剂：纤维素酶，Yakult Honsha产，批号：203016 纤维素酶，东京化成工业株式会社，批号：C0057 纤维素酶，Sigma公司，批号：C-2415 纤维素酶，Sigma公司，批号：C-7317 纤维素酶，Sigma公司，批号：950913
第二章制备黄原胶寡糖方法摸索19
6036酶，本实验室自产的一种从软体动物中提取出的壳聚糖酶，兼有纤 维素酶活性
半纤维素酶，Sigma公司，批号：9025-56-3 果胶酶，Serva公司
实验方法：
分别在50ml1%黄原胶溶液中加入上述酶30mg，反应温度保持为37°C，磁 力搅拌数小时。 结果及讨论：
上述酶皆没有降解黄原胶的能力，可见，尽管黄原胶的主链与纤维素相同， 但由于其独特的双螺旋结构以及侧链的保护，使得其性质非常稳定，市面上常 见的聚糖降解酶都不能将其降解，必须寻求其他的方法。
小结
强酸（如HCl以及H2SO4)在80C下可以水解黄原胶，而弱酸（如 CHsCOOH)不能水解黄原胶；
(2 )强碱NaOH不能水解黄原胶
(3 ) KMnO4以及NaIO4等氧化剂可以水解黄原胶，而H2O2以及(NHO2S2O4
无法水解黄原胶。
薄层层析的结果显示，化学方法降解的产物大多为单糖，因此如果降 解的目的产物是寡糖，则该方法不适用。
市面上常见的聚糖降解酶都不能将其降解，如要得到黄原胶降解酶， 则需要到野外筛选菌株。
第三章能够分泌黄原胶降解酶的菌株的筛选、纯化、鉴定以及该酶 的初步纯化、酶学性质的研究
随实验的进展，事态已日趋明朗，虽然这种明朗带着尴尬的色彩：要么如 大海捞针般采集到菌株，要么换题。
3.1能够分泌黄原胶降解酶的菌株的野外采集、筛选、纯化 实验方法：
将从野外采集到的土样悬浮于灭菌后的生理盐水中，并进行梯度系列稀释 后，接种于选择性液体培养基中，观察培养基的粘度变化。
选取培养基粘度明显变稀者用灭菌后的生理盐水进行梯度系列稀释，然后 按常规方法涂黄原胶平板，于30°C培养箱中培养过夜。分别挑出单个菌落的一 部分接种于黄原胶平板，于30°C培养箱培养过夜，作为保留菌种；另一部分接 种于选择性液体培养基，并于30C振荡培养（200 rpm)，观察培养基的粘度变 化。
选择性液体培养基组成：
Xanthan: 2.5g，（NH4) 2SO4: 0.5g，KH2PO4: 3.0g，K2HPO4: 3.0g，MgS〇4 ?7压0: 0.2g，FeCl3?6H2〇: 16.7mg，CaCl2?2H2〇: 0.66mg，ZnS〇4?7H2〇: 0.18mg， CuS〇4?5H2〇: 0.16mg，MnS〇4?4H2〇: 0.15mg，CoCl2?6H2〇: 0.18mg，H3BO3: 0.1mg，NaNO3: 2.0g，Na2MoO4?2H2O: 0.3mg，定容至 1L。
黄原胶固体培养基的组成（也用于斜面保存）：
琼脂粉：2°%，蛋白胨：0.1°%，酵母浸出粉：0.1°%，黄原胶：0.3°%，葡萄 糖：0.2°%，水：97.3°%
结果及讨论：
从黄原胶平板上挑取能使选择性液体培养基粘度明显变稀所对映的菌落，
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究21 在新鲜黄原胶平板上划线培养，选择单菌落，用选择性液体培养基进行复筛， 经对培养过程中培养液粘度下降程度和速度的比较，选出一株对黄原胶降解能 力最强的菌落作为研宄用菌，并暂命名为XT11。
一个多月的筛选结果令人兴奋，无疑成为了本课题得以顺利进行的里程碑 式事件。
3.2能够分泌黄原胶降解酶的菌株（XT11)的鉴定 实验方法：
黄原胶降解菌株的分类鉴定按〈〈伯杰细菌鉴定手册〉>和〈〈国际细菌分类学 杂志〉〉进行。
结果及讨论：
黄原胶降解菌XT11在细胞生长过程中呈杆状，老龄菌为球形，菌体形态不 规则；不形成芽孢，电镜照片显示无鞭毛，革兰氏染色阳性，抗酸性阴性，且 不运动。由〈〈伯杰细菌鉴定手册〉〉可知，应属于纤维单胞菌属Cejjujomonas。 但由于其不水解纤维素，又与已知纤维单胞菌属的各个种有区别，可能是 CehuJoffionas属中的一个新种。有关该菌株是否是一新种，尚需对其16s rRNA 系统发育树和DNA杂交数据分析后才能确定。
XT11的培养及发酵参数的确定 实验方法：
将活化后的黄原胶降解菌按1%(v/v)接种量接种至装有100ml黄原胶液 体培养基的250ml三角瓶中培养，培养温度为30°C，旋转式摇床转速为200rpm， 培养过程中每间隔一定时间取样，分别测定发酵液的0D600和上清液中的还原 糖含量（P-Hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH 法）及粘度。
所用黄原胶液体培养基的组成为：黄原胶：0.45%，葡萄糖：0.08%，蛋白 胨：0.1%，酵母浸出粉：0.1%，水：99.27%，pH7.0左右。
22黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
结果及讨论：
20
16
12
8
4
0
0123456
Ferment time (d)
一♦一细菌密度（OD480)—■一还原糖含量一▲一粘度
图2-1发酵液参数变化 Fig. 2-1 fermentation diagram
将黄原胶降解菌XT11接种于黄原胶液体培养基中培养，并测定培养过程中 的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变化，结果如图2-1所示。
由于发酵液的配比中加入了少量的葡萄糖来加快菌株的最初生长速度，当 有还原糖（葡萄糖）存在时发酵液的粘度没有变化，说明没有降解酶的出现， 在发酵两天后，发酵液中的葡萄糖耗尽，该菌株开始分泌降解酶降解黄原胶（现 象反映为还原糖的生成以及发酵液表观粘度的下降），因此有明显的二次生长 现象，可断定该酶为诱导酶。此外，发酵液中还原糖的大量生成滞后于发酵液 粘度的大幅降低，说明最先起降解作用的是主链降解酶（xanthase),伴随的还
原糖量持续升高则说明了发酵液中侧链降解酶（xanthan lyase)的存在。
产生黄原胶降解酶的时间为发酵两天后，然而由于此时发酵液的粘度仍然 很高，致使后续工作（如菌体的分离、酶的提纯等）很难进行，因此将从发酵 液中提取黄原胶降解酶的选择为接种后3〜4天，也即发酵液粘度大幅降低后的 最初时间。
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究23 3.4黄原胶降解酶的初步分离纯化
至此，关于黄原胶水解酶的报道，就我所能够查到的，只有九篇，而其中 仅有两篇分离纯化出了降解黄原胶的侧链酶（xanthan lyase)，而关于降解黄原 胶的主链酶（xanthase)仍未见关于分离纯化的报道。
酶的分离纯化，一方面可以直接获得其确切的性质信息，如分子量，三维 构象、酶的各种动力学参数等；另一方面，也可以再在获知其末端氨基酸序列 后，通过推测编码该酶的末端DNA序列，设计合理的引物，从而可通过PCR 调出并扩增编码该酶的基因，测定基因序列，从而明晰整个酶的氨基酸构成， 并且还为通过基因工程构建高表达该酶的工程菌提供了可能。
蛋白质的分离纯化，一般是应用在盐析点（如(NHO2SO4分级沉淀）、疏水 性（如疏水作用层析）、带电性（如离子交换层析、电泳等）、生物学特性（如 亲和作用层析）、分子大小（如凝胶过滤）等性质的差异来进行的。
而关于酶的分离纯化，由于其存在变性的问题，因此在方式的选择、具体 的操作过程中需要更加小心，譬如透析时间不应太长，离子交换层析时最好避 免强离子交换树脂的使用，分离纯化过程中注意其pH的变化范围等。
本文制定的分离纯化方式非常简单：
(NH〇2S〇4盐析►离子交换层析
3-4-1前期工作的准备：
测定酶活方法的建立：
由于黄原胶溶液的粘度很大，而当其分子主链被水解则粘度将下降，因此 原则上可用底物溶液粘度的下降速度来表示酶活力的大小。然而，实际上，由 于黄原胶溶液的假塑性很强，准确的测定粘度的大小对粘度计的要求很高。此 夕卜，另一个弊端则是测定粘度所需样品的量相对较大。
因此我选择用反应液中还原糖数量的增加速度来表示酶活力的大小，这也 是测定多糖水解酶的一般方法。
24黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
PAHBAH法测定还原糖：
PAHBAH 溶液的配制：取 0.5g PAHBAH 溶于 9.5ml 的 NaOH (5%)
PAHBAH法测定还原糖的方法：取200 y 1待测样品与150 y 1 PAHBAH溶液、 600 y 1 NaOH (5%)溶液混合，在120'C下加热15min，用酶标仪在405nm下
比色。
Glucose标准曲线
图3-2还原糖标准曲线 Fig. 3-2 The Standard Curve of Reductive Sugar
PAHBAH法测定还原糖标准曲线：
分别在水解管中加入0.5g/L的 Glucose 标准溶液 0^1，5^1，10^1，
30^1，40^1，并用双蒸水补至200 M。
向上述水解管中加入 150MPAHBAH溶液，再加入600 y1 NaOH (5%)溶液混合，在120 C下加热15min，用酶标仪在 405nm下比色。
结果如图3-2。
由此标准曲线可知，在此条件下，OD405的读数为0.1相当于0.018 ymo1
还原糖。
考马斯亮蓝测定蛋白含量标准曲线的建立：
用考马斯亮蓝染色蛋白，灵敏、快速、准确，目前已成为测定蛋白含量的 经典方法。
考马斯亮蓝染色液的配制方法参照《分子生物学实验手册》，科学出版社。
配制1g/L的牛血清蛋白（BSA)标准液。
向试管中分别加入0卟10^1，20|〇1，404，60^1，80^1，100MBSA标准液，
并用双蒸水补至相同体积0.1m1。
分别加入5ml考马斯亮蓝染 色液，充分震荡混合，2min 后在595nm下比色。
蛋白标准曲线
分别加入5ml考马斯亮蓝染 色液，充分震荡混合，2min 后在595nm下比色。
结果如图3-3。
图3-3蛋白标准曲线 Fig. 3-3 The Standard Curve of Protein
(NH4)2SO4 盐析（Salting out)
每种蛋白都有其特定的盐析点（salting-outpoint)，可根据此性质的不同而 将所要的蛋白与大量的杂蛋白分离开。
(NHO2SO4的溶解度随温度变化很小；且其中没有高价的重金属离子，一般 不会使蛋白变性，因此一向作为生化工作者使用盐析方法的首选。
对于此课题而言，从发酵液中提取酶，选择盐析的方法，不仅可以初步提 纯，还可同时还可起到大幅浓缩的作用。
实验方法：
将培养4一5天的发酵液（以培养液的粘度大幅度降低为根据）在9000rpm， 4°C条件下离心15分钟以除去菌体，留上清液备用。
向上清液中分别加入35%—80%不同饱和度的(NHO2SO4，静置40min,然后 在9000rpm，4°C下离心20分钟，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，分别测定酶活力。 测定酶活力方法：
用一定时间内酶解液中还原糖量的增加来表示，还原糖的测定用PAHBAH
pH=5.9，30^
法；
酶解反应时间为 黄原胶降解酶的 端所需的酶量为一个
结果及讨论：
(9〇寸§)迆饉
Fig 3-4 T
可见:
’0
图3-4 (NH4)2S〇4盐析结果 "he Purification Result of Salting-Out by (NH4)2S〇4
白在(NHO2SO4饱和度为45%时开始析出。
丨勺饱和度达到65%左右使蛋白活力达到峰值，超过65%则开
始盐溶。
因此，45%~65% 去尽可能多的杂蛋白
饱和度的硫酸铵可以最大限度地将黄原胶降解酶沉淀并除
〇
活力定义为每分钟催化形成相当于1 U mol葡萄糖的还原末 酶活力单位。
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究27 3.4.3 DEAE Sepharose 离子交换层析（Ion-exchange chromatography)
离子交换层析是利用吸附在离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种 物质的吸附力不同而使不同的物质分离的方法。由于各种酶等蛋白质在不同条 件下有相应不同的解离状态（也即带电状态），因此通过选择适当的交换剂，控 制交换和洗脱条件，就可将酶和杂蛋白分离开来。
对于分离酶而言，强的离子交换树脂可能会导致其变性。之前曾做过预试验， 在碱性条件下该酶会部分失活，因此，本文选择使用弱的阴离子离子交换剂 DEAE-Sepharose，并通过改变pH来达到分离纯化的目的。
试剂及主要仪器：
DEAE Sepharose: Pharmacia 公司，美国
自动组分收集器：上海精科科学仪器公司 电泳仪：大连科迈科学仪器公司产
实验方法：
将盐析后所得粗酶透析12h (中间换三次透析液），用冷冻干燥机干燥后， 再溶解于小体积的相同缓冲液中。上事先平衡过的DEAE-Sepharose柱(pH=5.9)， 用含有0.7M/1 NaCl的相同缓冲液线性梯度洗脱（流速1ml/min)，并收集活性 蛋白组分。
合并活性组分并透析12h (中间换三次透析液）后，用冷冻干燥机浓缩，再 次上DEAE-Sepharose柱（pH=4.9)，用含有0.7M/1 NaCl的相同缓冲液线性梯 度洗脱（流速1m1/min)，收集活性组分，透析12h (中间换三次透析液），浓 缩成固体后-20°C冷藏保存
将收集到的活性组分透析后冷冻干燥，然后用少量缓冲液溶解后用电泳检 测提纯结果。
结果及讨论:
DEAE Sepharose(pH=5.9，留取52-62管）
图 3-5 DEAE-Sepharose 分离结果（pH=5.9)
Fig 3-5 Xanthanase5s Purification by DEAE-Sepharose (pH=5.9)
1#
DEAE Sepharose (Ph=4.92)
■4—protein—H—NaCl 洗脱浓度
—the first enzyme acctivity—^—the second enzyme acctivity
图 3-6 DEAE-Sepharose 分离结果 Fig.3-6 Xanthanase’s Purification by DEAE-Sepharose
可见：
硫酸铵沉淀下蛋白中仍含有相当量的糖，这些糖对于后续的酶活力及其 他性质的分析带来了一定的影响，由于这些糖并不挂柱，因此在第一次 DEAE-Sepharose层析时（pH=5.9)可将其完全除去。
相当一部分的杂蛋白不挂柱。
活性组分在过第一次DEAE Sepharose柱时（pH=5.9)，在NaCl浓度约为 0.3 Mol/L时被洗脱。
将过第一次DEAE Sepharose柱后收集的活性组分过第二次DEAE Sepharose柱（pH=4.9)，洗脱下两个活性峰，记为1#峰和2#峰。1#峰 不挂柱，2#峰仍在NaCl浓度约为0.3mol/L时被洗脱下。由黄原胶的结 构推测，这两种等电点性质截然不同的酶（很显然，1#蛋白峰的等电点 应该为4.9左右）很有可能分别是降解主链酶和降解侧链酶，这需要日后 验证。
或者是操作的问题，或者是方法的问题，每次过柱后蛋白的回收率很低， 往往是尝试了几次后就再也检测不到蛋白及酶活了。
3.5黄原胶降解酶的提纯结果
从2002年4月初到10月末，历时7个月，我执意要将此酶提纯，然而， 最终，在毕业时间的刻薄敦促下，我尽管极度不甘心，还是放弃了。
电泳的结果：
Hg. 3-7即是最终的电泳结果，
由于酶的余量很小，因此虽然电泳 结果很不美观却没有机会重新弥 补。
2# 1#
如标注所示，1#与2#分别表示 1#蛋白峰与2#蛋白峰的提纯结果。 可见这两个泳道中显示的分别为两 条清晰的蛋白条带。
图3-7黄原胶降解酶的分离纯化的电泳结果 Fig.3-7 Xanthanase purification result5s detection by electrophoresis
最终纯化的总结果如下表:
表3-1黄原胶降解酶的分离纯化结果
Table 3-1 The results of xanthanase' Purification
StepTotalTotalSpecific activityRecoveryPurification
activity/uprotein/mg/(u/mg)/%/fold
Crude enzyme348111231.71001
(NH4)2SO4 Precipitation2054105.319.559.011.5
DEAE- Sepharose(pH=5.9)16263.3348.446.728.5
Chromatography
DEAE-Sepharose(pH=4.9)214.30.73293.56.2172.6
Chromatography(peak 1#)
DEAE-Sepharose(pH=4.9)333.70.86388.19.6228.3
Chromatography( peak 2#)
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究31
3.6黄原胶降解酶的酶学性质研究
由于并没有纯化出黄原胶的降解酶，因此，研宄酶学性质所用的酶皆为过 了一次 DEAE Sepharose 柱（pH=5.9)的粗酶。
本节所研宄的酶学性质包括：温度、pH、金属离子对酶活力的影响，以及 此酶的底物专一性和酶的动力学方面的研宄。
3.6.1温度对黄原胶降解酶的影响 实验方法：
分别在 25'C、30'C、35'C、40'C、50'C下测定酶活（pH=5.9)，以 30'C为基 准（100%)。
结果及讨论：
结果如图3-8:
该酶的最适反应温度为30 °C~40°C。
该酶的温度敏感性较高，
X1-AISB SA--s05
20%
在45C下保温一小时活力 就只剩下28.6%，50C下保 温一小时活力只剩14.6%。
0%
20
304050
Temperature (C)
60
•Oh
•1h
•3h
在40C, 45C, 50C下分别保温1h、3h,然后用保温后的酶在30C水浴中 测定酶活，以没有保温的酶活为基准（100°%)。
图3-8黄原胶降解酶的最适温度及温度稳定性 Fig. 3-8 Temperature’s Influence on Xanthanase
pH对黄原胶降解酶的影响 实验方法：
分别在 pH=4.4、4.9、5.9、7.0、8.0、9.2 下于 30°C水浴中保温 0、1、3 小时
用保温后的酶测定酶活，以在pH=5.9下保温0小时的酶活作为基准
(100%)。
结果及讨论：
120% ■
-AIP^QA--Q^
100%
345678910
pH
—♦—0h1h—k—3h
图9黄原胶降解酶的最适pH及pH稳定性 Fig. 9 Influence of pH on Xanthanase
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究33 3.6.3金属离子对酶活的影响以及Ca2+对EDTA2-抑制作用的补偿 实验方法：
金属离子对酶活的影响：
在不同金属离子存在时测定酶活（30°C，pH=5.9)，以没添加金属离子的 酶活作为空白对照（CK，100%)，除Na+和K+为150mM/L外，其余的金属离子浓 度皆为1mM/L。
Ca2+对EDTA2-抑制作用的补偿：
在EDTA存在下（0.6mMol/L)，加入不同量的Ca2+，测定酶活，以不含EDTA 和Ca2+的酶活为空白对照（CK，100%)。
结果及讨论：
120% 100%「 100%
Relative activity
80%
60% 40%
0%
n
0%
0
1
2
3
4
钙离子浓度（mMol/L)
图3-11 Ca2+对受EDTA抑制的酶活的补偿作用
Fig. 3-11 Influence of Ca2+ on Xanthanase’s Inhibition by EDTA
图3-10金属离子对酶活的影响 Fig. 3-10 Influence of Ions on Xanthanase’s Activity
可见：
20%
主族的二价离子Ca2+、Mg2+对酶活没有影响，高浓度的主族一价离子Na+、
34黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
K+对酶活有一定程度的影响，过渡金属离子Co2+对酶活有一定的影响，
而过渡金属离子Hg2+、Zn2+、金属离子螯合剂EDTA的存在则几乎可使 其完全失活。
由Ca2+对Na2EDTA抑制作用的补偿实验结果（Fig. 3-11)可知，Ca2+能 很大程度地缓解EDTA对酶活的抑制作用。
推测其原因，可能是由于主族的二价金属离子（如Ca2+，Mg2+等）对于 维持此酶活性的必要性一一要么是直接的活性中心，要么是作为辅基而 起辅助性作用。正常情况下此酶中并不缺少此类金属离子，因此Mg2+和 Ca2+的加入并不能影响酶活，而加入EDTA后，由于其螯合了酶中的此类 金属离子而使酶活大幅降低，通过向溶液中添加Ca2+可使酶活得以恢复。 而就主族的一价金属离子、过渡金属离子而言，由于对酶中的金属离子 存在着竞争而将其置换下来，从而导致酶活力不同程度的损失。
第三章黄原胶降解菌的筛选、纯化、鉴定，降解酶的初步纯化、以及酶学性质研究35 3.6.4底物专一性的研究 实验方法：
分别以纤维素、淀粉、葡聚糖、木聚糖、昆布多糖、卡拉胶（T)，卡拉胶 (入），卡拉胶（K)作为酶解底物(均为Sigma公司产)胶作为底物的酶活为基 准（100%)，测定酶活（30°C，pH=5.9，酶解 30min)。
结果及讨论：
表3-2黄原胶降解酶的底物专一性研究 Table 3-2 Substrate Specificity of Xanthanase
Substrate黄纤淀葡木昆卡卡卡瓜果山
石海菊多聚半乳
原维粉聚聚布拉拉拉胶胶藻藻粉糖醛酸
胶素糖糖多胶胶胶聚酸
糖⑴(K)糖钠
Relative100900000235180410012
activity/
%
如Table 3-2所示：
该酶具有高度底物专一性，除黄原胶外，对其它多糖仅有较低的降解酶活性， 如：纤维素（9°%)，卡拉胶（A) (23°%)，瓜胶（18°%)，海藻酸钠（10%)， 多聚半乳糖醛酸（12°%)。
按化学结构分析，这些可被部分酶解的多糖共分为两类：
结构类似型：纤维素的主链与黄原胶相同，而瓜胶的结构与黄原胶相似， 也为线性主链上连着以0-1，6糖苷键联接的侧链；
有相似基团型：此类型多糖与黄原胶一样都有酸性中心（比如卡拉胶上 的硫酸基、多聚半乳糖醛酸上的半乳糖醛酸等）。
而对于淀粉、木聚糖、昆布多糖等中性多糖，则完全不能被降解。
3.6.5黄原胶降解酶的动力学研究
本节通过使一定量的酶与不同量的底物反应，控制反应时间为足够短，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，做 出V-S曲线及1/V-1/S曲线，从而求出米氏方程（Michaelis-Menten equation)、 米氏常数（Michaelis constant)以及最大反应速度Vmax。
实验方法：
V-S曲线及1/V-1/S曲线
将一定量的酶与不同浓度的底物（S)混和，酶解时间准确控制为15min (30 C，pH=5.9)，测定还原糖的生成量，除以酶解时间作为酶解速度（V)。以 V-S以及1/V-1/S作图。
EDTA对酶活抑制后的V-S曲线及1/V-1/S曲线
将一定量的酶与不同浓度的底物（S)混和，加入EDTA，使其在反应体系 中的浓度为1mMol/L，酶解时间准确控制为15min(30°C，pH=5.9)，测定还原 糖的生成量，除以酶解时间作为酶解速度（V)，以V-S以及1/V-1/S作图。 结果及讨论：
(1)没有抑制作用下的V-S
V-S曲线
80 r
Vmax __
1 1/V-1/S曲线
1/V-1/S曲线
0.14
0.12
u o o o o
b 5 4 3 2 < (M*UJm) /°mrl>>
y = 0.0099x + 0.丨 R2 =
4
S(ug/ml)
图 3-12 V-S 曲线 Fig. 3-12 V-S Curve
1/S (ml/^g)
图 3-13 1/V-1/S 曲线 Fig. 3-13 1/V-1/S Curve
由V-S曲线以及1/S曲线可得：
米氏常数（M/c办故）Km=0.26 |jg/ml
最大反应速度 Vmax=72pmol/(min*g)
因此，如果该酶的动力学方程符合⑶伽％繼//+训，
a 当 S«Km时，V=Vmax*S/Km=277*S b 当 S>>Km 时，V=Vmax=72umol/(min*g) c 当 S 与 Km接近时，V=Vmax/ (Km+S)=72/(0.26+S)
在EDTA抑制作用下的V-S曲线和1/V-1/S曲线
EDTA抑制下的1/V-1/S曲
则:
EDTA抑制作用下的V-S曲线
0.3
y = 0.0135x + 0.0017
o o o o
5 4 3 2 < (M*UJm) /°mrl>>
10
0
70
Vmax，
60
QomTl/M*UJm) >
0.05
0
0510
S(ml/ug)
图3-14 EDTA抑制下的1八- Fig.3-14 1/V-1/S Curve with EDr
01 Km，234
S(ug/ml)
图3-13 EDTA抑制下的V-S曲线 Fig.3-13 V-S Curve with EDTA，s Inhibition
由图3-13和图3-14可得：
I•在EDTA抑制下的V-S曲线是明显的S形曲线 典型的别构 的形状，因此此时酶的动力学方程并不符合米氏方程，虽然此 的酶得来，但我仍推测该酶为别构酶，也因此我认为，以1/V- 有实际意义。
II.最大反应速度为63pmol/(min*g)
15
20
1/S 曲线 TA，s Inhibition
酶动力学曲线 曲线由未纯化 -1/S作图并没
将两个图放在一起比较的结果
将两种情形的图叠加在一起结果会更为明晰。
S(ug/ml)
—H—V-S Curve without inhibition
—▲—V-S Curve with EDTA inhibition
图3-16无抑制剂的V-S曲线以及加入EDTA后的V-S曲线 Fig. 3-16 V-S Curve Without Inhibition and V-S Curve With EDTA Inhibition
有EDTA抑制时酶对底物（黄原胶）的Km值明显增大(Km’>Km)，而Vmax 并无太大变化，推测是EDTA螯合并从而占据了酶中的可能与底物的结合作 用密切相关的金属离子的位点，从而使酶与底物结合的能力大大减弱，只有 当底物浓度大大过量时，才能恢复其原有的反应速度。
推测此酶是别构酶。虽然不添加EDTA使得曲线的S型并不明显，但如很多 别构酶那样，在有抑制剂（EDTA)存在时，增大了底物（黄原胶）与酶结 合过程中的协同性，使得V-S曲线变为明显的S型曲线。
小结
成功地从野外采集、筛选、纯化了一株能够分泌黄原胶降解酶的菌株， 并对该菌株进行了初步鉴定，确定为属中的一个新种。
通过盐析以及离子交换层析对黄原胶降解酶进行了初步的分离纯化，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻， 最终分离出的两个蛋白峰的纯化倍数分别达到172.6倍和228.3倍。
对黄原胶降解酶的性质进行了研宄，确定该酶的如下性质：
A•最适反应温度为30°C〜40°C，且热稳定性较差；
B•最适pH范围为pH=5.0〜7.0，pH稳定性较强。
该酶的底物专一性很强；
—价、二价的主族金属离子对酶活没有影响，而过渡金属离子 以及EDTA则会大幅降低酶活力，加入Ca2+后能够很大程度的缓 解EDTA的抑制作用；
通过作出V-S曲线以及1/V-1/S曲线，确定了 Km(M/ctoefo comto故），最大反应速度Vmax，并从而求出了 M/c办aeto-Mewtew equation；
通过作出EDTA抑制下的1/V-1/S曲线，推测该酶为别构酶。
40黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
第四章黄原胶降解的寡糖产物组成、结构的初步分析
在目前的生化领域中，对糖的研宄，无论是深度还是广度，都大大滞后于 对核酸、蛋白质等生物大分子的研宄，原因是多方面的，客观方面的大致有以 下几个：
糖分子本身结构极为复杂。糖，作为基因的二次产品
^〇办你），与基因的一次产品蛋白质相对应，本身的结构调控不如蛋白质 那么严格，使得在许多糖链中都存在着微不均一性（Microheterogeneity)。 多糖和寡糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过糖苷键连接而 成，各羟基在环上有顺反异构，且每个单糖分子上有多个手性碳，因此， 与组成的核酸分子的区区4种核苷酸以及组成蛋白质分子的20种常见氨 基酸相比，单糖的种类极为繁多；此外，与核酸以及蛋白质这些线性聚 合物不同，糖分子的结构要复杂得多一一它身上挂着的数个性质相对活 跃的羟基使得其可拥有庞杂的侧链分支。
难于对糖进行分析分离。造成这一结果的主要原因是构成糖分子的单糖 的性质极为相似，许多不同的单糖间仅仅相差了一个羟基的朝向，如葡 萄糖和甘露糖，这就使得不同的糖分子之间的性质差异性相对不大，因 此，在很多情况下，无法使用传统的如利用极性、带电性、挥发性等性 质差异显著的常规分离方法。
标准品的极度匮乏。这是个历史沉积的原因，因此而造成的尴尬的结果 是，在费尽周折将样品中的组分分离开，却由于没有标准品而无法对其 结构组成最终盖棺定论。
下面的图示是人类在分析糖组成方面的走过的大致足迹。
Carbohydrate Composition Analysis
>
Paper chromatography
(1970s)
HPLC (1980S|—
HPCE(1991，
Substitution of all ^
polar groups (producing volatile derivatives)
▼
GLC
—►FID (1960s)
▼
MS (1970s)
Derivatization-
Introduction of fluorescent tags by reductive amination
HPLC (1^0s)
▼
HPCE (1990s)
►HPACE-PAD (early 1990s)
图4-1糖类分析方法的历史足迹
Fig. 4-1 Approaches for carbohydrate composition analysis: A historic perspective.
对于此课题，黄原胶酶解的寡糖产物的结构、组成分析主要利用了 HPAEC-PAD (high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)，以及 MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)。
4 1利用HPAEC-PAD分析黄原胶酶解产物的组成
这是上世纪九十年代初出现的分析糖的新技术，主要原理为在高pH值的环 境中用离子交换柱将样品中的各个组分分开，然后用脉冲式电信号检测。
该方法灵敏度高，所需样品量极少；分辨率高，在适当的条件下应用该技 术甚至可将葡萄糖和甘露糖分开；该方法的另一个优点是不需要对糖样品进行 衍生化，因此应用非常方便，尤其是对于寡糖这样的小分子生物物质而言尤为 如此。
实验目的：
分析不同酶解时间下酶解产物的种类、以及产物随时间的变化趋势，并寄 希望于通过分析各组分在柱上的滞留时间的不同，并根据实验室已有的研宄经 验，推测出关于酶解产物结构方面的信息。
4 1.1黄原胶寡糖的制备 实验方法：
在800ml磷酸盐缓冲液（60mmol/L，pH=5.9)中加入12g黄原胶，并加入 0.2g粗酶，30°C下机械搅拌，按酶解时间的不同取样，将取样后的酶解样品煮 沸5min灭活。标号1#，2#，3#，4#，分别表示酶解1、2、3、4天的
产物。
结果与讨论：
由于此前曾酶解过一次，当时的底物浓度选取为0.5%，加入酶很短的时 间后（数分钟）底物溶液的粘度就大幅下降。因此，为了充分显示酶解 不同时间的产物的差别，此次将底物浓度提高至1.5%，结果证明浓度过 大：由于底物粘度过高而致使机械搅拌不动，从而导致酶与底物接触不 充分，使得直至第四天酶解液的粘度才大幅下降。
在酶解的过程中，酶解液的pH不断下降，因此为保持酶活力，应不时添
第四章黄原胶降解的寡糖产物组成、结构的初步分析43
加NaOH以保证pH值在6.0左右。
在酶解的过程中，酶解液中出现一定量的白色沉淀，且量随酶解时间的 增长而逐渐增多。一开始曾怀疑是变性的蛋白，然而该白色沉淀的量分 明比加入的蛋白量多。后来根据黄原胶的分子结构推测可能是由于侧链 酶切掉了黄原胶的侧链，从而生成了没有侧链的“黄原胶” 一一纤维素。 用I2—一Zn〇2法染色测定该白色沉淀是否为纤维素 I2—一ZnCk试剂的配制参照《植病研宄方法》第三版，71页，中国农业出 版社。
ZnCl2:2.5g, KI:8g, l2:1.5g, H2〇:8ml
先将Zn〇2和KI溶于水中，再加入I2溶解，静置几天后取上清。
取一玻璃皿分别在上放置少许黄原胶、微晶纤维素以及发酵液中的白色沉 淀，然后分别在上面滴加I2——ZnCl2试剂。
黄原胶不变色，呈试剂的本身的淡黄褐色。而纤维素以及白色沉淀滴加试剂
后呈相同的蓝黑色，证明该白色沉淀确为纤维素
因此：
此混合酶中含有黄原胶的侧链酶，从而产生纤维素。
对于以黄原胶寡糖（Oligoxanthan)为主要目的产物的酶解实验而言，将 底物转变为纤维素不啻为一种浪费。要么纯化出主链酶与侧链酶，从而彻底 解决这一问题；要么控制反应时间，可能部分挽回损失。
4.1.2利用HPAEC-PAD分析黄原胶酶解产物 实验仪器及工作条件：
ESA(USA)公司的582型泵，542型自动进样器，Coulchemll电化学监测 器及CoulArray for windows色谱工作站，HAMILTON RCX-10阴离子交换柱。
流动相：A:100m Mol/L NaOH; B:100m Mol/L NaOH + 500m Mol/L NaAC 吸脱条件：柱温 30°C;流速 1.0ml/min。0〜20min，5°%B~30°%B; 20〜25min， 30%B; 25〜45min，5%B，5%B 平衡色谱柱。
结果及讨论：
Fig. 4-2-1 HPLC of Xanthan Gum
Xanthan gum 谱图
Fig. 4-2-1 HPLC of Xanthan Gum
oligoxanthan HPLC 谱图
图4-2-3黄原胶寡糖(1#)HPLC谱图
Fig. 4-2-3 HPLC of Oligoxanthan (1#)
20.030.0
Retention time (minutes)
图4-2-4黄原胶寡糖(2#)HPLC谱图
0.0
10.0
40.0
Fig. 4-2-4HPLC of Oligoxanthan(2#)
Retention time (minutes)
I ' I 20.030.0
Retention time (minutes)
图4-2-5黄原胶寡糖(4#)HPLC谱图 Fig. 4-2-5 HPLC of Oligoxanthan(4#) 图4-2-6黄原胶寡糖(5#)HPLC谱图 Fig. 4-2-6 HPLC of Oligoxanthan(5#)
图4-2-7黄原胶寡糖(6#)HPLC谱图 Fig. 4-2-7 HPLC of Oligoxanthan(6#) 图4-2-8黄原胶寡糖(7#)HPLC谱图 Fig. 4-2-8 HPLC of Oligoxanthan(7#)
图4-2-9黄原胶寡糖(8#)HPLC谱图
Fig. 4-2-9 HPLC of Oligoxanthan(8#)
图4-2-10黄原胶寡糖(9#)HPLC谱图
Fig. 4-2-10 HPLC of Oligoxanthan(9#)
图4-2-11黄原胶寡糖(12#)HPLC谱图 Fig. 4-2-11 HPLC of Oligoxanthan(12#)
9876543213
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16.0_
14.0.
12.0_
10.0_
8.0
2.03.0
Retention time (minutes)
将各个样品的谱图排列在一起进行更为直观的比较
图4-3黄原胶及黄原胶寡糖的HPLC谱图 Fig. 4-3HPLC of Xanthan and Oligoxanthan
第四章黄原胶降解的寡糖产物组成、结构的初步分析47
结论如下：
黄原胶分子只产生一个单峰（标号为①），如Fig. 4-3-1，Fig. 4-3-2所示，
出峰时间为1.42min，与进样峰时间相同，说明黄原胶在此条件下不挂柱。黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻， 可能由该分子太大而只能从填料中间穿过导致。
酶解的寡糖产物并不复杂，如Fig.4-2-10所示，有6个比较明显的产物峰
(按照出峰时间的先后分别标为②、③、④、⑤、⑥、⑦)，其中③峰与
⑦峰较强。
酶解产物的变化趋势为：随酶解的进行，第一天出现了②、③、⑤、⑦ 峰，第二天④峰也开始出现，到了第四天，这6个峰全部出现直至终止 酶解反应。③峰在第四天达到峰值随后逐渐变小，⑦峰在第五天达到峰 值后在随后的时间里也呈下降的趋势。⑤峰偶尔会裂解为两个小峰，可 能是由于其分子上的某个基团（如丙酮酸、乙酰基）脱落所致。其余几 个峰的峰面积变化不明显。
令人疑惑的是，没有哪个峰的峰面积随酶解时间的延长而增加，因此无 法确定哪个峰是酶解的终产物。
4.2利用MALD卜TOF-MS分析黄原胶酶解产物的组成
激光解吸电离质谱（LDI-MS)早已被作为分析难挥发有机物的最有效的手 段之一，曾用于分析合成聚合物和热不稳定生物小分子的研宄。但是激光解吸 测定的分子量范围均低于3kDa，这在很大程度上限制了该技术的应用。一直到 1988年，Tanaka和Hillenkamp两组科学家分别提出用基质辅助激光解吸电离质 谱（MALDI-MS)后，才使得该技术应用于生物大分子的分析得到大大发展。
MALDI与其他质谱电离源技术相比，对样品的要求很低，能耐受高浓度的 盐、缓冲剂和其他非挥发性成分，并且灵敏度很高。此外，在MALDI谱图中单 电荷分子离子峰占主要地位，且碎片离子少，因而这一技术是混合物分析的理 想手段。
目前，MALDI-TOF-MS已成为分析蛋白质、糖类等难挥发类生物分子的常 规方法。
实验目的：
通过酶解不同时间的寡糖产物的谱图，由各组分的分子量以及黄原胶的分 子结构来推测各个组分的分子结构信息，并因此推测酶解过程以及靶点。
实验仪器以及工作条件：
All experiments were performed on a Bruker Autoflex time-of-flight mass spectrometer ( Bruker, Bremen, Germany ), equipped with a pulsed nitrogen laser operated at 337 nm and every mass spectra were obtained in the positive-ion reflectron mode. 2,5-Dihydroxybenzoic acid was selected as the matrix.
结果及讨论：由于操作方法方面的原因，将质谱的监测区间分为数段：MW: 500〜1600; 1600〜3000; 3000〜8000;经检测，所测样品（Oligoxanthan 4#、5#、
6#、7#、8#、9#、12#)皆在且仅在分子量范围为500〜1500之间有信号峰的出 现，在其余区间检测不到信号。
Intens. [a.u.]
1500
1000
500
寸卜e.IS-
£9”s'
nr"6_
66S 366,
ss-/.'
0
I I I II I I ^~II I I |~II~I I |I I I I (~II~I-~*|~II~I I | II I I (~II~I-~*| I I~V I | It-
6007008009001 0001 1 001 2001 3001 4001 500
图4-4黄原胶寡糖（4#)(MW: 500〜1600) Fig 4-4 Oligoxanthan (4#) (MW： 500-1600)
Intens. [a.u.]
1 500 "
1 000
500
6007008009001 0001 1 0012001 30014001 500
图4-5黄原胶寡糖（6#)(MW: 500〜1600)
Fig 4-5 Oligoxanthan (6#)(MW: 500〜1600)
Intens. [a.u.]
4000
3000
2000
1000
0
10
1
"669卜6
60070080090010001 1001200130014001500
图 4-6 黄原胶寡糖（8#)(MW: 500~1600) Fig 4-6 Oligoxanthan (8#)(MW: 500~1600)
可见：
所有的检测样品的谱图非常类似。尽管酶解时间长短相差很大，各个谱 图的信号峰的种类、数量以及所显示的分子量信息等都看不出明显差异。 说明酶解产物组成随酶解时间只有量变，没有质变。
图中明显的信号峰有6组（由于有些信号是单纯的分子离子峰，有些是 加上H+的离子峰，有些则是加上Na+的离子峰，有的是加上K+的离子峰， 因此分子量依次相差23、16的信号峰实际上是同一物质的信号峰，用一 组括号表示）：
：（569、585)，酶解产物的实际分子量为546;
：（605、621);酶解产物的实际分子量为582;
：（697、713);酶解产物的实际分子量为674;
：（743、765、781);酶解产物的实际分子量为743
：（935、951)酶解产物的实际分子量为912
：（954、976、992);酶解产物的实际分子量为954
其中较强的两组峰为④：（743、765、781)以及⑥：（954、976、992)， 其余的信号相对较弱。
根据谱图带来的分子量信息，并联系黄原胶自身的分子结构，可推测出 这六种酶解产物——黄原胶寡糖的结构，结果如下表：
表4-1 Oligoxanthan组分结构 Tab. 4-1 The Structure of Oligoxanthan
标号质谱谱
图显示
的分子
量推测的Oligoxanthan产物分子结构推测的 Oligoxanthan
结构的分子量
①546546
②582582
③674CHzOAC674
④743(JOONa h£^744
⑤
⑥
912
954
912
954
如果此黄原胶降解酶为严格意义上的外切酶，则无论酶切位点位于主链 还是侧链，其酶解产物都是单糖，而不可能出现寡糖；
如果此酶为严格意义上的内切酶，则酶解产物的种类也不至于如此单一， 酶解产物的分子量分布范围将不仅局限于如此狭窄的范围内——最大的 寡糖产物将不会只有五糖。
综上所述，并且结合分析酶解产物的组成及结构，可以清楚地看出，该 酶既非严格意义上的外切酶，也不是严格意义上的内切酶，而是处于两 者间的“准外切酶”。它的酶解作用位点专一，它“由外至内”地将构成 黄原胶的五糖单元逐个剥离，致使酶解产物组成相对单一，主要酶解产 物即是构成黄原胶的基本单位一一五糖单元（⑥，⑤是⑥脱去乙酰基的 产物）以及在外切酶作用下再脱去一个外端单糖的四糖（④）。外切酶还 可以继续作用，形成了如四糖、三糖等其他寡糖产物。
酶解过程示意图如图4-7:
下
^准外切酶 酶切位点
在“准外切酶”作用
图4-7酶解过程示意图 Fig. 4-7 The Process of Xanthan Gum5s Degradation
(①）
在外切酶作用下脱 去单糖
外切酶
酶切位点
单糖
外切酶 酶切位点
小结
由HPAEC-PAD分析的结果：
黄原胶分子只产生一个单峰，与进样峰重叠，说明黄原胶在此条件下不挂柱。
酶解的寡糖产物有6个比较明显的产物峰。
酶解产物的变化趋势为：随酶解的进行，第一天出现了 4个峰，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，第二天另一 个峰也开始出现，到了第四天，这6个峰全部出现直至终止酶解反应。其中 两个峰随酶解时间的增长，峰面积达到峰值后在随后的时间里又开始逐渐减 少。
令人疑惑的是，没有哪个峰的峰面积随酶解时间的延长而一直增加。
由MALDI-TOF-MS分析的结果是：
所有的检测样品的谱图非常类似。说明酶解产物组成随酶解时间只有量变， 没有质变。
谱图中明显的信号峰有6组，与HPLC的分析结果相对应。根据其分子量信 息以及黄原胶的结构推测出黄原胶降解产物寡糖的结构。
确定了酶解的主要产物为五糖单元，并确定了酶解位点，并推测出酶解过程。
第五章黄原胶寡糖的生物活性探寻
前已述及，与蛋白质和核酸相比较而言，人们对糖的研宄相对落后。造成 这一局面的原因，除了在上一章谈到的糖分子本身的客观性质外，还与人们的 主观认识有关。
人们曾错误地认为，糖分子的主要作用是与能量相关，如淀粉、糖原等， 以及结构分子，如纤维素、细胞壁中的肽聚糖等，而其本身并不具备多少生物 学功能。然而，如同人类已犯下的种种天真的错误一样，人们再次大大低估了 糖分子本身的作用。近几十年，尤其是随着分子生物学的蓬勃发展以及人类基 因组计划的轰然展开，科研工作者们发现，在许多生物体中（尤其是真核生物 中）表达的基因产品往往发挥不了预期的作用，比如大量的包涵体的带着尴尬 色彩的出现。追根溯源，人们发现了糖链在蛋白的稳定化作用等方面的不可替 代的作用，并借此将人们引入了生物学领域中的另一处桃花源一一糖生物学 至此，人们已经确定，除了能量方面的作用外，糖分子（很多 情况下以糖复合物-Glycoconjugate的形式存在）在生物体内还有着极其重要、 广泛的生物学作用，从组织结构、免疫调节、信号转导、分子识别，到保证蛋 白质的水溶性以及稳定其构象等，其作为信息分子对于细胞的识别、增生、分 化以及维持生物体免疫系统、生殖系统、神经系统和新陈代谢平衡都具有重要 的作用，同时，有些寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤、抗病毒、 抑菌、利于肠道双岐杆菌增殖、植物诱抗、提高免疫力，等活性，可作为绿色 农药、人体保健品以及药物应用。其中，以研宄寡糖的生物学功能以及作用机 理为主要任务的寡糖工程（Oligosaccharide Engineering)已成为了目前国际上 的一个研宄热点。
黄原胶，这种由植物致病菌一一野油菜黄单胞菌一一分泌的胞外多糖，酶 解后的寡糖产物（Oligoxanthan)是否拥有某种生物学活性，目前仍未见报道， 它也是研宄该课题的最终目的。
本课题主要对Oligoxanthan的抑菌、植物诱抗、抗病毒、抗氧化四方面的生 物学活性进行了研宄。
5.1 Oligoxanthan抑菌活性的探索
5.1.1 Oligoxanthan抑制真菌的生物活性的探索
供试病原菌：
玉米大斑病菌如rc/cww )、番茄早疫病菌（d/terwar/aso/aw/)、
瓜类枯萎病菌（i7似ar/ww ox少腦…辣椒疫霉（尸办決ora c學《+c，+)
以上囷株皆为本实验室保减。
实验方法：
本实验采用常规的固体培养基加药法。
菌种准备：用PDA培养基培养上述菌种，备用。
打制菌饼：在无菌条件下，将供试菌种用〇6mm的打孔器打出一定数量 的菌饼备用。
含Oligoxanthan的培养基的制备：分别将滤菌后的4#，6#，8#，12# Oligoxanthan溶液注入加热溶解的PDA培养基中，使Oligoxanthan的浓 度为1000ppm，迅速摇匀后，每个平板取10ml，每种菌种的每个处理3 次重复。以加入等体积水的培养基作为对照（CK)。
含Xanthan的培养基的制备：方法同上，将Oligoxanthan换成1000ppm 的Xanthan溶液。
接菌：在无菌条件下将菌饼移至培养基上，菌丝面朝下，每皿中央放一 块菌饼，置26°C温箱中培养。
测量数据：待对照皿（CK)菌落长满皿时，测量其余处理的菌落直径。
结果与讨论：
抑菌率计算公式：
抑菌率=(对照皿中菌落直径-处理皿中菌落直径）/(对照皿中菌落直径-打孔器 直径）*100%
Inhibition of oligoxanthan on the growth of Exserohilum turcicum
(1)对玉米大斑病菌（Exserofe'/wTO如rc/cMW )的抑制结果
图5-1黄原胶寡糖对玉米大斑病菌的抑制
Fig. 5-1 Inhibition of oligoxanthan on the growth of E:xseroh'i/-um turcicum
Inhibition of oligoxanthan on the growth of Alternaria solani
(2)对番茄早疫病菌（d/temari+a so/ara+)的抑制结果
图5-2黄原胶寡糖对番茄早疫病菌的抑制 Fig. 5-2 Inhibition of oligoxanthan on the growth of A/ternaria so/ani
Inhibition of oligoxanthan on the growth of Fusarium oxysporum
(3 )对瓜类枯萎病菌的抑制结果
图5-3黄原胶寡糖对瓜类枯萎病菌的抑制 Fig. 5-3 Inhibition of oligoxanthan on the growth of Fusarium oxysporum
Inhibition of oligoxanthan on the growth of Phytophthora capsici
'^ ,丄-rj
Xanthan 4# 6# 8# 12#
图5-4黄原胶寡糖对辣椒疫霉的抑制 Fig. 5-4 Inhibition of oligoxanthan on the growth of Phytophthora capsici
可见：
1000ppm的Xanthan溶液对真菌没有抑制作用；
Xanthan降解的产物Oligoxanthan对真菌有较强的抑制作用。当浓度为 1000ppm时，对在PDA培养基上生长的真菌的最大抑制率分别为：
对玉米大斑病菌为38.4%;对番茄早疫病菌为39.7%;对瓜类枯萎病菌为 25.4°%;对辣椒疫霉为：34.9%。
抑制率对酶解时间做图：
60.00% r
45.00% r 40.00%
_ 35.00%
30.00%
25.00%
^ 20.00%
15.00%
CH_1_
^ 10.00%
10.00% -
(％) uomqjqul
50.00% r
0.00%
051015
Enzymic degradation time (d)
图5-6不同酶解时间的黄原胶寡糖对 dfterwar/a的抑制
Fig. 5-6 Variant Enzymic Degradation Time Effect on the Inhibition of Oligoxanthan on the Growth of A/ternaria so/ani
0.00% 111
051015
Enzymic degradation time(d)
图5-5不同酶解时间的黄原胶寡糖对 ErseroMwm twrcicwm 的抑制 Fig. 5-5 Variant Enzymic Degradation Time Effect
on the Inhibition of Oligoxanthan on the Growth of Exserohi/um t^urcic^um
40.00% r
@ 30.00%-
a
20.00% -
■rH
•r-
f 10.00% -
0.00%
051015
Enzymic degradation time (d)
0.00%
051015
Enzymic degradation time (d)
5.00% -
图5-8不同酶解时间的黄原胶寡糖对 Phytophthora capsici 的抑制 Fig. 5-8 Variant Enzymic Degradation Time Effect on the Inhibition of Oligoxanthan on the Growth of Phytophthora capsici
图5-7不同酶解时间的黄原胶寡糖对
的抑制
Fig. 5-7 Variant Enzymic Degradation Time Effect on the Inhibition of Oligoxanthan on the Growth of Fusarium oxysporum
可见，对真菌的抑制作用随酶解时间的不同而变化，总趋势为，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，酶解 时间越长，抑制率越低。分析其原因，可能是由于随酶解时间的增长，寡 糖分子的大小（如从五糖变为四糖，或由四糖变为三糖）发生改变，或是 由于寡糖分子上的基团（如乙酰基，丙酮酸）脱落，从而，构成的不同造 成对真菌抑制作用的差异。结合上一章的分析Oligoxanthan组成的HPLC 谱图的内容，“③峰在第四天达到峰值随后逐渐变小，⑦峰在第五天达到 峰值后在随后的时间里也呈下降的趋势，”可能这两种组分（或其中一种) 就是抑制真菌生长的主要原因。
仍有一定量的工作需日后进行，如在抑制真菌活性作用中起主要作用的 组分的结构，抑菌机理以及产生最大量抑菌活性组分的工艺条件（如酶 解时间）的摸索。
Oligoxanthan抑制细菌的生物活性的探索
有一些多糖，其自身并无抑菌活性，而当用酶活其他手段将其降解为一定 分子量范围的低聚物时，则具有明显的抑菌效果[1]。为研宄Oligoxanthan是否有 抑制细菌的作用，本实验选取了数种有代表性的细菌：既包括植物致病菌、又 包括人体致病菌，既有革兰氏阳性菌，又有革兰氏阴性菌。
供试病原菌：
实验所用菌株皆为本实验室保藏菌种，具体名称如下：
革兰氏阴性菌：大肠杆菌（ECo//),白菜软腐病菌（E.Carotovora),烟草青 枯病菌（尸)，柑桔溃疡执owowas1)
革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌（^gac/Z/ws wto+fo1)，金黄色葡萄球菌 (Staph/ococcus aureaus)
实验方法：
细菌生长的培养基选择为LB培养基。
将灭菌后的滤纸片（直径6mm)浸泡在无菌的黄原胶寡糖溶液（6000ppm) 中，30°C下浸泡24h备用。
将上述菌株在LB液体培养基中活化后，用移液枪移取200 y l致密平铺 到LB平板表面。
将滤纸片贴到培养基上，在温箱中培养24h(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 在37C下培养，其余菌株在28C下培养)，观察并测量抑菌环直径。
结果及讨论：
在平板上几乎看不到抑菌圈的出现，因此，浓度为6000ppm下的 Oligoxanthan，对于这几种菌株都没有任何的抑制作用。
参考文献：
唐传核，天然抗菌防腐剂[J]。四川食品与发酵，1999，（4)： 26-28
64黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
Oligoxanthan植物诱抗生物活性的探索
寡聚糖作为植物免疫激活因子的基础研宄始于上世纪60年代。Ayers等于 1976年发现细胞壁的寡糖碎片能诱导植物植保素（phytoalexin)合成[1]。1985 年P. Albersheim首次提出了寡糖素（oligosaccharins)这个新概念，并认为寡聚
糖具有调控植物生长、发育、繁殖、防病和抗病等功能，能够刺激植物的免疫 系统反应。活性寡聚糖可发出某种具有调节功能的信息，激活防御反应，调控 植物生长，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成[2]。
我个人认为，这种寡糖诱导植物产生抗性的最深层的原因在于“模拟”，即 它模拟了病害入侵植株时植株所能感受到的环境状况。拿目前研宄较多的植物 及微生物细胞壁多糖降解的寡糖片断来举例，（多种此类多糖都被证明有植物诱 抗的活性)，当病害入侵时，一方面，病菌（包括病毒）必须水解植物细胞壁多 糖才能进入细胞，此时产生的植物细胞壁的寡糖碎片就激活了植物的防御系统; 另一方面，植株也可做出积极的防御反应，它所分泌的细胞壁水解酶可降解病 原菌表面的细胞壁，产生了一定量的微生物细胞壁寡糖碎片，这些碎片也可激 活植物的防御系统产生植保素。因此，当直接将活性寡糖喷洒在植株的叶片表 面时，这些寡糖（或者是植物细胞壁降解的寡糖碎片，或者是微生物细胞壁降 解的寡糖碎片，或者是病原菌所分泌的特定多糖的寡糖碎片）就促使植物“误 以为”病原菌已经开始入侵，而这些寡糖就是它们入侵的号角声，因此，为了 保护自己，植物开启了己体的防御系统。
人类的这一发现的高明之处在于，从此可以人为地控制植物的防御系统， 给植物“种牛痘”打预防针。
根据这一理论，由十字花科植物致病菌野油菜黄单孢菌分泌的黄原胶的寡 糖碎片很有可能拥有植物诱抗的活性。
实验方法：大豆子叶法（Soybean Cotyledon Bioassay)[3],
豆科植物在受到病原体侵染时，能通过莽草酸途径、醋酸-丙二酸途径或醋
酸-甲羟戊酸途径，产生以异黄酮类为主的植保素，直接杀死入侵的病原体，抑 制病斑的扩大。在外源激发子的处理下豆科植物也能够产生抗性反应，合成植 保素。大豆子叶法就是利用激发子处理大豆子叶，然后通过测定子叶产生的植 保素的量，来表示激发子诱导抗性活性的方法。
大豆的培养：大豆种子用水洗净后，用8%次氯酸钠溶液灭菌20min，再用 无菌水冲洗干净，暗光震荡24h。次日将种子播种在光照培养箱中（光照：黑暗 =16h: 8h)交替培养10d,带大都长出两片真叶后即可进行活性测定。
活性测定方法：
剪下已经长出两片真叶的大豆子叶，用8%次氯酸钠溶液灭菌5min，然后用 无菌水冲洗干净，再用滤纸吸干。在无菌条件下用刀片削去子叶外表皮厚约 1mm,直径约6mm的伤口，用无菌水浸泡清洗，约30sec后取出，用滤纸拭干 后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿放10片子叶作为一个处理。取配置好的样品 溶液（含有2mg/ml的链霉素）1〇W加在伤口上。处理后的子叶在25°C黑暗的温 箱中培养24h，将每皿中的子叶转移到一个盛有10ml双蒸水的试管中，充分震 荡后测定OD286。每个样品三个处理。
结果及讨论：
0
-0.0 丨 -0.
5#
6#
7#
图5-9 Oligoxanthan大豆子叶法测定植物诱抗活性结果 Fig. 5-9 Result of Oligoxanthan by Soybean Cotyledon Bioassay
Oligoxanthan的植物诱抗活性测定
Oligoxanthan有一定的植物诱抗活性，最高值达到0.14，然而并没有预计的 活性高。
可能的原因为：
植物自身生长的不确定性。这仅为一次试验的数据，由于影响植物产生 植保素的因素很多（如病菌的侵染、外力造成的损伤等），本次实验的对 照值过高（达到0.213)。还需要日后的实验重复。
Oligoxanthan的浓度影响。本次试验选择的浓度为6000ppm，根据本实验 室对壳寡糖（Oligochitosan)诱抗活性的研宄经验，寡糖浓度过大反倒会 降低诱抗活性。因此日后还需做浓度梯度对诱抗活性影响的实验。
植物的选择。这一通用的侧植物诱抗活性的大豆子叶法选择的作用对象 是大豆，而分泌黄原胶的菌株一一野油菜黄单孢菌却是十字花科植物的 致病菌，因此作用对象的不匹配可能也造成了读数偏低。
参考文献：
Ayers AR, Ebel J, Fineli F, etal. Host-pathogen interactions XI, Quantitative assays of elicitor activity and characterization of the elicitor present in the extracellular medium of cultures of
Phytopothora megasterma var.sojae[J]. Plant Physiol, 1976,57:751
Albersheim P, Valent BS. Host-pathogen interactions in plants, Plants, when exposed to oligosaccharides of fungal origin,denfend themselves by accumulating antibiotics[J]. The Journal of Cell Biology, 1978, 78(3):627
Cheong JJ, Birberg W, Fugedi P, Pilotti A, Garegg PJ, Hong N, Ogawa T, Hahn MG Structure-activity relationships of oligo-^-glucoside elicitors of phytoalexin accumulation in soybean. Plant Cell(1991) 3: 127-136.
Oligoxanthan抗病毒活性的探索
对Oligoxanthan抗病毒活性的探索包括三方面的内容：
抑制病毒的初侵染
对病毒的体外钝化作用
抑制病毒的增殖
要探索能否将Oligoxanthan开发成生物农药，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，则这三方面是研宄抗病毒方面 的有机的研宄整体，缺一不可。研宄抑制病毒的初侵染是研宄其是否具有“未 雨绸缪”的功效，即提前向植物喷洒oligoxanthan能否抑制病毒侵害，相当于“将 来时”；研宄对病毒的体外钝化作用则是研宄Oligoxanthan对病毒的直接作用， 即在病毒入侵时喷洒Oligoxanthan能否起作用，相当于“进行时”；研宄直至病 毒的增殖则是研宄Oligoxanthan有否“亡羊补牢”的功能，即在植物遭病毒侵害 后还能不能进行补救，相当于“过去时”。
5.3.1抑制病毒的初侵染 实验方法：
(1)0.05mol/L pH=5.5磷酸盐缓冲液（PBS)的配制
配制方法参照《现代植物生理学实验指南》，科学出版社 A 液：0.05mol/L 的 Na2HPO4 溶液 B 液：0.05mol/L 的 KH2PO4 溶液 将A液与B液按照0.75: 9.25 (V/V)的比例混和即得。
准备病毒
取20g感染烟草花叶病毒的烟草叶片放入研钵，加入10ml磷酸盐缓冲液后 充分研磨，用纱布过滤，取滤液加入少许石英砂作为病毒的接种液。
病毒的接种
采用半叶法涂布叶片一一选取大小相似的、长有6〜8片叶片的烟草植株，
68黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
在每株植株上选取两片叶位相同的叶片的左半部涂布Oligoxanthan (6#，用 750ppm，1500ppm，3000ppm3个浓度尝试），右半部用水涂布。
在涂布Oligoxanthan后1d后接种病毒用毛笔蘸取新鲜的病毒接种液轻
轻的在涂布过黄原胶寡糖的叶片（全叶）表面摩擦；并用相同方法在没有涂布 Oligoxanthan的叶片上接种病毒作为对照，力求在每片叶片上的摩擦次数及用力 大小一致。
结果及讨论
接种10d后查数叶片上的病斑数。
(1)制病毒的初侵染率结果
抑制病毒的初侵染率公式：
(对照叶片病斑数-处理过的叶片病斑数）/对照叶片病斑数*100% 结果如下：
Oligoxanthan抑制病毒的初侵染率结果
黄原胶寡糖的浓度(ppm)
图5-10 Oligoxanthan (6#)抑制病毒的初侵染率结果 Fig. 5-10 Inhibition of Oligoxanthan (6#) on First Attack of Virus
(2)涂布Oligoxanthan的半片叶片与未涂Oligoxanthan的半片叶片的病斑 数是否存在显著的差异性
由于实验选取的叶片数目较多，因此采用统计学的方法，给定a=0.05 检验假设：
H〇:阳=屮-P2=0; H1:p〇=屮-P2乒0;并假设 D=X-Y~N(阳，〇D2)，其中
PD=E(X)-E(Y)=p.2，
〇 D2=Var (X-Y)
检验统计量T=Daver/SD*(n-1)1/2服从自由度为n-1的t-分布，给定a =0.05 使：P(Daver /SD(n-1)1/2)>t(n-1,0.975)=0.05
对于CK：
n=12，查表得，t (11，0.975) =2.1783，因此临界域 |T卜2.1783，
T= Daver/SD*(n-1)1/2=0.1667/37.16018*111/2=0.015，
AT值落在临界域外，因此接受原假设，也即认为CK的左半片叶片与右半片叶 片无显著性差异。
对于750ppm Oligoxanthan处理后的叶片：
n=26，查表得，t (25，0.975) =2.0555，因此临界域 |T|>2.0555，
T= Daver/SD*(n-1)1/2=-2.74074/26.12778*251/2=-0.524
•••T值落在临界域外，因此接受原假设，也即认为用750ppmOligoxanthan处理 过的的左半片叶片与未经处理的右半片叶片无显著性差异。
对于1500ppm Oligoxanthan处理后的叶片：
n=13，查表得，t (12，0.975) =2.1604，因此临界域 |T|>2.1604，
T= Daver/SD*(n-1)1/2=1.230769/22.50242*121/2=0.189
• T值落在临界域外，因此接受原假设，也即认为用1500ppm Oligoxanthan处
70黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻
理过的的左半片叶片与未经处理的右半片叶片无显著性差异。
对于3000ppm Oligoxanthan处理后的叶片：
n=26,查表得，t (12, 0.975) =2.1604，因此临界域 |T>2.1604,
T= Daver/SD*(n-1)1/2=-6.23077/22.07243*121/2=-0.978
•••T值落在临界域外，因此接受原假设，也即认为用3000ppm Oligoxanthan处 理过的的左半片叶片与未经处理的右半片叶片无显著性差异。
讨论：
Oligoxanthan有非常强的抑制病毒的初侵染率
在Oligoxanthan的浓度为750ppm时，抑制病毒的初侵染率达到52.7°%，当 浓度增至1500ppm和3000ppm时，抑制病毒的初侵染率则分别达到75.3°%和 79.5%。
并且，其抑制病毒的初侵染率随着寡糖浓度的增大而增强，当寡糖浓度为 1500ppm时抑制率接近峰值。
Oligoxanthan处理过的的左半片叶片与未经处理的右半片叶片无显著 性差异
处理叶片的方法采用了半叶法涂布，然而，无论是经哪种浓度寡糖处理的 叶片，其左半部叶片（涂布过Oligoxanthan)与右半部叶片（未涂布过 Oligoxanthan)上的病斑数并无显著性差异。
Oligoxanthan抑制病毒的初侵染的机理很有可能是作为诱导物诱导 植物产生系统抗性
可见，Oligoxanthan抑制病毒的初侵染不是（或很大程度上不是）由于寡糖 分子自身的功能，如可能阻碍病毒与宿主细胞的结合、侵入等；而很有可能是 作为诱导物开启了植物细胞中的信号传递系统，产生了一系列的信号物质，从
而使植物内部产生了系统抗性。
仍需一定量的日后工作
Oligoxanthan诱导植物产生系统抗性的最佳时间（即涂布Oligoxanthan后多
长时间产生的抗性最强）、浓度等参数，以及宄竟是Oligoxanthan中的哪一种（或 几种成分）在起作用，仍需要进一步的研宄。
5-3-2对病毒的体外钝化作用
实验方法：
病毒接种液的准备
取20g感染烟草花叶病毒的烟草叶片放入研钵，加入10ml0.05mol/L磷酸盐 缓冲液(pH=5.5)，充分研磨，用纱布过滤，取滤液并在其中加入少许石英砂。
将病毒滤液分为三份，与黄原胶寡糖溶液混合，使混合后溶液中寡糖的含 量为 750ppm，1500ppm，3000ppm。
病毒的接种
选取大小相似的、长有6~8片叶片的烟草植株，在每株植株上选取叶位、 大小相近的新叶作为实验用。
分别使Oligoxanthan与病毒作用0min、30min、120min后，用毛笔蘸取寡
糖与病毒作用的混合物，轻轻的在选取叶片表面摩擦，力求在每片叶片上的摩 擦次数及用力大小一致。
结果及讨论
接毒10d后查叶片上的病斑数目。
黄原胶寡糖对病毒的体外钝化作用探索
图5-11黄原胶寡糖对病毒的体外钝化作用探索结果 Fig. 5-11 Inhibition of Oligoxanthan (6#) on Off-body Passivation of Virus
750ppm ■S— 1500ppm ■A— 3000ppm
以Oligoxanthan与病毒的作用时间为横坐标，对叶片上的病斑数作图如下:
可见：
a)横向对比的结果：三条曲线形状都相对平直，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，不大的波动可用生物生长 的个体植株生长差异性来解释。
这说明叶片上的病斑数并未因Oligoxanthan与病毒的作用时间的不同而 改变，因此，就每一种浓度的Oligoxanthan对病毒的体外钝化效果而言， 都没有明显的钝化作用。
(2)纵向对比的结果：曲线上的点相互间非常接近。
这说明烟草叶片受病毒侵害的程度不仅与Oligoxanthan与病毒的作用时 间无关，还与寡糖的浓度无关，这也从另一个侧面说明了 Oligoxanthan对 病毒没有明显的体外钝化作用。
5.3.3抑制病毒的增殖 实验方法：
病毒源的准备：同5-3-1及5-3-2 病毒的接种：同5-3-1
接毒3天后（病斑刚刚在叶片上出现）剪下叶片，将叶片沿中轴线剪为两 半，一半浸入水中作为对照（CK)，一半浸入Oligoxanthan溶液（浓度分别为 750ppm、 1500ppm、 3000ppm)
中处理，每个处理15片叶子，数天后观察叶片病班的大小。
结果及讨论：
选取接毒后3d，5d，7d，10d的叶片作为考察对象，处理的叶片对对照叶 片上的病斑大小没有差异，说明没有明显的抑制病毒增值作用。
Oligoxanthan抗氧化活性的探索
1969 年 McCord 和 Fridovich发现了超氧化物歧化酶（Superoxide dimutase,
SOD)的作用，此后，自由基（Free radical)医学日趋成熟。自由基在生理、病
理过程中的作用越来越引起有关学者的关注：自由基不仅可与生物体内的许多
物质如脂肪酸、蛋白质等作用，夺取它们的氢原子，还能造成相关细胞的结构
发生变化，从而造成人的衰老、动脉硬化、心脏病、癌症等。因此，人们不断
地寻求天然的或合成的抗化化活性物质，这些物质主要通过清除自由基，或阻
断自由基的产生，或将业已形成的自由基逆转为原来的生物大分子而体现活性
[1]
目前已发现数种多糖及其衍生物拥有抗氧化的活性，如螺旋藻多糖 (polysaccaride from 分如//而 p/ate服+S, PSP) [2]、壳聚糖[3]、鼠尾藻多糖 (Sargassum thunbergii polysaccharide, STPS) [4]、硫酸多糖类[5]，然而，对于寡 糖抗氧化活性的报道不多。
本节是对黄原胶寡糖的抗氧化活性的首次报道。
主要试剂及实验仪器：
DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)，Sigma 公司 a-tocopherol，Sigma公司，乙醇，市售分析纯 实验方法：
DPPH •是一种稳定的自由基，在有机溶剂（如乙醇、甲醇）中呈紫色，在 517nm处有强吸收。加入抗氧化剂后，一部分自由基被清除，使吸收减弱，可借 此来评价该物质的抗氧化活性，并已成为鉴定一种化合物是否有此活性的经典 方法。具体操作参照 Brand-Williams(1995)[6]。
(1)标准曲线的配制（以a-tocopherol作为阳性对照的标准品）
将DPPH •溶于乙醇中，配制200 y mol/LDPPH •溶液。
将 a-tocophero 溶于乙醇中，配制 0 y mol/L，12.5 y mol/L，25 y mol/L，50
U mol/L，100 u mol/L 的 a -tocophero 溶液
将DPPH •溶液与a-tocophero溶液在水解管中等体积混合，向反应体系中 通入氮气置换出其中的空气，立即旋紧盖子。
避光反应60min后测定反应液的OD517。
(2)黄原胶寡糖清除DPPH ■作用的测定
将要测定的试样换为Oligoxanthan (5#、6#、7#，3000ppm)，其余步骤
同上
结果及讨论：
DPPH •清除效率的计算：
DPPH •清除效率^Ao-A-AJhlOOQ/o/Ao
其中，A。： DPPH •溶液+有机溶剂的吸光度；Ai: DPPH •+抗氧化剂溶液的 吸光度；A2:有机溶剂+抗氧化剂溶液的吸光度。
DPPH scavenging activity of a -tocopherol
(％)91s uo-Jqil
Fig. 5-12 DPPH scavenging activity of a -tocopherol
(1)阳性对照a-tocopherol对DPPH ■清除效率标准曲线的绘制
(2)黄原胶寡糖对DPPH ■的清除效率
(o--eJ^uy^USAeo^^^^0
70.00%
60.00%
50.00%
40.00%
30.00%
20.00%
10.00%
士
士
士
DPPH scavenging activity of xanthan gum and oligoxanthan
0.00% L
Xanthan 5#6#7#8#9#12#
gum
图5-13黄原胶以及黄原胶寡糖清除DPPH结果 Fig. 5-13 DPPH scavenging activity of xanthan and oligoxanthan
可见：
黄原胶（Xanthan)没有抗氧化活性。
黄原胶的降解产物（Oligoxanthan)有较强的抗氧化活性，且随酶解时间的 增长，酶解产物的抗氧化活性增大。在浓度为3000ppm时，12#清除DPPH 效率达到63%，相当于40 y mol/L a -tocopherol的清除效率。由于 Oligoxanthan是混合物，并且目前仍不知道Oligoxanthan中的哪一组分为活 性组分以及此活性组分占总体的份额，因此暂时无法在同一摩尔浓度下与a -tocopherol比较抗氧化活性的大小，黄原胶的降解产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻，相同质量的Oligoxanthan混合物的抗氧 化活性相当于a -tocopherol的56°%。
令人疑惑的是，综合上一章分析Oligoxanthan组成的HPLC谱图结果，没发
现哪个峰自始至终随酶解时间的增长而变大，因此无法推断出拥有抗氧化活 性的组分结构。
参考文献:
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陈东坡，宋晓梅等。甲壳质对氧自由基致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用）[J]。中国 海洋药物，1998，17 (1): 28
张尔贤等。鼠尾藻多糖清除氧自由基作用的研究I[J]。中国海洋药物，1995，14(1): 1
田晓华等，褐藻硫酸多糖清除活性氧自由基作用及动力学的ESR研究[J].营养学报， 1997，19 (1): 32
Brand-Williams,W.Use a frss radical method to evluate antioxidative activity. Food Sci.Technol.1995, 28, 25-30
小结
对黄原胶寡糖的生物学活性进行了探讨，发现：
(1) Oligoxanthan拥有较强的抑制真菌生长的能力，
(2 ) Oligoxanthan对细菌则没有抑制作用；
Oligoxanthan有很强的抗病毒初侵染活性，但对病毒没有体外钝化作用， 也不能抑制病毒的增殖。
(4 ) Oligoxanthan有一定的植物诱抗活性 (5) Oligoxanthan有较强的抗氧化活性。
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