黄原胶(Xanthan gum)是一种野油菜黄单胞菌或甘蓝黑腐病黄单胞菌发酵生产的微生物胞外多糖， 又称汉生胶，简称XC。无味、无臭、无毒、食用安全、易溶于水，稳定使目前国际上黄原胶被广泛应用于 食品、石油、陶瓷、纺织、印染、医药、造纸、地矿、灭火、涂料、化妆品等20多个行业，是目前世界上生产规 模最大且用途极为广泛的微生物多糖。

但在黄原胶的应用过程中，其黏度过高也带来一些问题，如在提高采油率的同时也増加后继工艺如 原料运输及产品的成本。因此需要找到能有效降解黄原胶的方法。同时黄原胶的降解产物寡糖还具有 抗病毒、抑菌、诱导植物抗性、提高免疫力等功能，可进一步开发利用。因此，可以高效降解黄原胶的微 生物菌株具备生产应用的潜在价值[3]。

研究采用常规筛选法从野外采集的土样中分离到52株放线菌菌株，然后通过平板筛选和摇瓶验证 法初步筛选出降解黄原胶作用较强的5株，再经过紫外诱变育种选育和摇瓶验证法筛选到5株可高效 降低黄原胶黏度的放线菌突变菌株[4]。对这5个突变株进行了摇瓶发酵条件的摸索，初步确定了发酵

参数。

1材料与方法

1. 1菌种

2006年7月从新疆天山白杨沟采集耕作层土壤，随后到2006年底从中分离得到放线菌菌种52

株[5]。黄原胶：市售。

1.2 培养基 14,6’7]

1.2.1固体斜面培养基

MgS〇4.7H2〇(0.05%)，FeS〇4.7H2〇(0. 001%)，NaCl(0.05%)，KN〇3(0. 1%) ’K2HP〇4(0. 05%) ’淀粉 (2%)。

制法:将淀粉加入少量水调成糊状加入培养基中，每300 mL培养基中加3%铬酸钾1 mL，以抑制细 菌和霉菌的生长，高压灭菌(121 °C，30 min)，pH用1 N的NaOH调到7. 9~ 8. 1。

1. 2. 2种子摇瓶发酵(Bennett’s)培养基

酵母膏0. 1%，牛肉膏0. 1%，葡萄糖0. 1%，酸水解酪蛋白0. 2%，麦芽浸粉0. 2%，pH 7. 3~ 8. 0。

1.2.3摇瓶发酵培养基

黄豆饼粉3%，可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉0. 5%，NaCl 0. 1%，K2HPO4 0. 05%，CaC〇3 0. 4%， pH7. 3~ 7. 4。

制法:先用水将黄豆饼粉，可溶性淀粉及酵母粉调匀，再加入其它成分，pH调至8. 5,然后加入 CaC〇3。培养条件:500 mL三角凹底瓶，瓶口纱布塞，装液量100 mL，pH 7. 9~ 8. 1，121 °C灭菌30 min。

1.2.4 0.2 m PBS 缓冲液

Na2HP〇4 30. 6 g，NaH2P〇4 2. 5 g 以水定容至 500 mL，121 °C灭菌 30 min。

1.3研究方法

通过选择性平板(氨卞青霉素、四环素、卡那霉素)筛选出黄原胶降解酶的放线菌菌株1~ 2株。以 物理(紫外线)、化学诱变技术，定向选育黄原胶降解酶的高活性放线菌菌株。

1.3.1诱变筛选法

(1)紫外线诱变

原始菌种(CK)—接 Bennett’s 液体培养基培养(30°C，200 r/min，16~ 24 h) — 5 000 r/m 离心 3 min，收菌体—PBS缓冲液洗3次，5 000 r/min离心3 min —用PBS缓冲液将菌体稀释至108个菌体/mL 的菌悬液—紫外线处理(30 min，60 min)—5 000 r/m离心3 min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，5 000 i/m 离心3 min^稀释，涂平板，挑取尽量不一样的单菌落，划斜面保存^接发酵培养基摇瓶发酵，测定黄原 胶粘度。

评价放线菌的降解作用可用最直观的方法，如:平板筛选中测透明圈的大小，摇瓶筛选中测黏度等。

(2)平板筛选法

把固体斜面培养基上长的放线菌点接到以黄原胶惟一碳源的固体培养基平板上(30°C恒温箱里)观 察是否出现透明圈并用卡尺测量透明圈直径(放线菌在高氏1号培养基平板上产透明圈是因为有淀粉 酶，培养基里的作碳源的淀粉换成黄原胶后出现透明圈是说明放线菌降解了黄原胶）。

(3)摇瓶筛选法

把平板筛选出的黄原胶降解菌接到放线菌液体培养基(Bennett’s)上放线菌长好以后再加黄原胶。 选择黄原胶量时按淀粉的量初步定0. 5和0. 7 g，把包好的黄原胶灭菌，灭菌以后在超净工作台上进行 操作。做比较实验最后定0.5 g，因为黄原胶量多了会影响降解速度，量太少了黏度计测不出来。

摇瓶发酵将降解菌反应黄原胶，并测定培养过程中的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变化。当有还 原糖，存在时发酵液的粘度没有变化，说明没有降解酶的出现[3]。发酵72 h后，发酵液中的葡萄糖耗 尽，该菌株开始分泌降解酶降解黄原胶，因此有明显的二次生长现象，并断定该酶为诱导酶。此外，发酵 液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度的大幅降低，说明最先被降解的应是主链结构[3]。

(4)黄原胶粘度测定方法

直接取含降解菌的黄原胶发酵液，用NDJ- 5S型旋转式粘度计，在25 °C，2#转子，60 r/min条件下 直接进行测定。

(5)降解率

黄原胶降解率的计算式:（对照黏度-该菌黏度)/对照黏度 1.3.2摇瓶发酵条件的初步研究

设计了不同碳源、氮源的不同组合的3种摇瓶液体培养基进行5个突变菌株的摇瓶发酵条件的初 步研究，通过测定发酵液中黄原胶粘度下降的情况，初步确定了菌株的摇瓶发酵条件。表1 

表1 3种摇瓶液体培养基配方

Table 1 Three kinds of flask medium

培养基编号Medium No.1 号 No. 12号 No. 23 号 No. 3

FeS〇4-7H2〇0. 001%--

MgS〇4- 7H2〇0. 05%--

NaCl0. 05%-0. 1%

KNO30. 1%--

K2HPO40. 05%-0. 05%

可溶性淀粉 Soluble sta'ch powder2%-3%

黄原胶 Xanthan gum---

酵母賞 Yeast extract-0. 1%0. 5%

牛肉賞 Beef ext met-0. 1%-

酸水解酪蛋白Casein hydrolysate-0. 2%-

葡萄糖Glucose-0. 1%2%

麦芽浸粉Malt extract-0. 2%-

黄豆饼粉 Bean cake powder--3%

CaCO3--0. 4%

1.3.3摇瓶培养条件

摇瓶发酵量用500 mL三角瓶装液100 mL,菌龄为72 h,转速200 r/ min,温度30 °C，pH 7. 1~ 8. 0。

2结果与分析

2.1自然筛选的黄原胶降解菌的初步平板筛选

最初从土壤里筛选出50多株放线菌菌种，把它们划在以黄原胶为惟一碳源、氮源为无机氮源的平 板中，筛选出降解黄原胶的菌株。

看见出现透明圈，这说明放线菌降解了黄原胶的黏度，并根据透明圈的大小挑选出6、9、16、17、18 号降解作用较好的放线菌菌株，并进一步进行摇瓶发酵筛选验证。表2

表2放线菌降解黄原胶形成的透明圈及透明带的情况 Table 2 The degrading transparent circle and belt of actinomyces strains on the agar medium

菌株编号

Actinomyces S:rains number

6789121416171821

1. 91. 3 1. 31. 651.01. 01. 51. 45 1. 851. 3

2. 11. 3 1. 21.51.01. 21.251. 5 1. 61. 4

透明带宽度(cm)

Width of transparent belt of line inoculating

透明圈直径（cm)

Diameter of transparent circle of spot inoculating

注:透明带指划线接种时菌线周围形成的透明带;透明圈指点接时菌落周围形成的透明圈

Note The transparent belt of line inoculating indicates the transparent belt formed around the agar mediam by xanthan degrading function of actinomyces strains when being line inoculated;The transparent circle of spot inoculating indicates the transparent circle suriounding the colony when being spot inoculated

2.2初步筛选的黄原胶降解菌的摇瓶验证

结果表明黄原胶的黏度有明显的降解，黏度最终降解到0,降解率达到100%。摇瓶的降解黏度时 间为12 d，这时间太长，成本高。下面进一步研究降低成本的方法。表3

表3放线菌因降解黄原胶而降低发酵液黏度的作用

Table 3 Flask solution viscosity declining by xanthan- degrading actinomyces strains

菌株编号 Strains numberCK678916

黏度 Viscosity (mPa_ s)2721000012

降解率 Xanthan degrading mte( % )0961⑴10010095

注：添加的黄原胶0.5%;CK:对照，没接放线菌的黄原胶摇瓶

Note:The percentage of xa^itha^i gum added into flask is 0. 5% , ; CK is the control that flask contains same amount of xa^itha^i gum but without

2.3诱变对黄原胶降解作用的影响

一切生物都有遗传变异性，而且微生物的遗传变异特性尤为明显[3]。黄原胶降解菌的筛选及诱变选育，在筛选出的几十个菌株中，选 降解作用较理想的5个菌株进行紫外诱变(诱变时间为0. 5和1 h)，平板筛选，选择出透明圈较大的菌 落。结果表明，诱变菌种的透明圈比原始菌大，有较好的降解作用。1、3、6、18和20号诱变菌株的透明 圈较大.并进一步进行摇瓶发酵筛选验证。表4

表4放线菌诱变菌株降解黄原胶形成的透明圈及透明带的情况 Table 4 The transparent drde and belt formed by xanthon degrading mutated from

actinomyces on the agar medium

菌株编号 Strain No.透明带宽度(cm)

Width of transparent aeaof line inoculating透明圈直径（cm) Dia of transparent cycle of spotinoculating

重复1 Duplicate 1重复2 Duplicate 2重复 3 Duplicat e 1重复1 Duplicate 1重复2 Duplicate 2重复 3 Duplicate 3

11. 821.91.71.92. 01.9

32. 22. 52. 01. 752. 21.8

41.32. 11.91.11. 82. 0

61.81. 92. 02. 01. 81.7

71.42. 21.71.22. 11.5

122. 72. 01.81.72. 11.6

172. 01. 71.81.81. 51.8

182. 252. 02. 12. 02. 02. 2

201.52. 32. 31.72. 32. 5

221.21. 71.91.11. 52. 2

注:透明带指划线接种时菌线周围形成的透明带;透明圈指点接时菌落周围形成的透明圈

Note: The transparent belt of line inoculating indicates the tra^isparent belt foimed on the agarmedium byxa^itha^i degrading function of actinomyces strains when being line inoculated; The tra^isparent ciicle of spot inoculating indicates the tra^ispaient circle surrounding the colony when being spot inoculated

2.4诱变对黄原胶降解菌影响的摇瓶验证

在平板筛选出的菌种中选择透明圈比较大的5个菌种做摇瓶筛选，黄原胶降解菌的筛选及诱变选育，进一步验证了诱变确实提高了 放线菌对黄原胶黏度的降解作用。结果表明黄原胶的黏度明显下降，同时摇瓶的降解黏度时间缩短到 4 d。诱变提高了黄原胶降解出发菌株的降解活性，突变株18号发酵液中完全降解黄原胶(粘度降到0) 需要8 d，比出发菌株所需要12 d缩短了 4 d，到4 d时，突变株18号的粘度己显著降至73 mPa. s。表5

表5诱变菌株因降解黄原胶而降低发酵液粘度的作用 Table 5 Fermentation solution viscosity of mutational strains was decreased because of degrading of xanthogen gum

摇瓶发酵液粘度 Flask fermeDtatioii solution viscosity (mPa. s)

菌株编号 Mutant No.发酵 4 d

Fermentation for 4 days发酵8d

Fermentation for 8 days发酵12d

Fermentation for 12 days

CK565565565

出发菌株 Forthfaing strains4664590

突变株 20 Mutation strains 203641020

突变株 6 Mutation strains 63001270

突变株 1 Mutat ion strains 1216710

突变株 3 Mutat ion strains 3151200

突变株 18 Mutation strains 187300

注：添加的黄原胶0.5% ; CK:对照，没接放线菌的黄原胶摇瓶

Note: The percentage of xanthan gum added into flask is 0. 5% ; CK is the control that flask contains same amount of xanthan gum but without

actinomyces strains

2.5摇瓶发酵条件的初步研究

不同组合的3种摇瓶液体培养基进行5个突变菌株的摇瓶发酵条件的初步研究，通过测定发酵液 中黄原胶粘度下降的情况，摇瓶发酵培养基确定为2号。

3 结论

3.1初步从南山采集的耕作层土壤中自然筛选出50多株放线菌菌种，黄原胶降解菌的筛选及诱变选育，把它们划在黄原胶做惟一碳源， 氮源为无机氮源的平板上，观察出现透明圈。因为放线菌分泌降解酶降解黄原胶。进行摇瓶筛选是为 了进一步鉴定放线菌降解黄原胶的作用，测定摇瓶培养过程中的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变化。 当有还原糖，存在时发酵液的粘度没有变化，说明没有降解酶的出现。发酵72 h后，发酵液中的葡萄糖 耗尽，该菌株开始分泌降解酶降解黄原胶，因此有明显的二次生长现象，并断定该酶为诱导酶。此外，发 酵液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度的大幅降低，说明最先被降解的应是主链结构。

3. 2进行诱变以提高其降解黄原胶的活性，最终选育到5株降解黄原胶的放线菌菌株，把原始菌与紫 外线诱变得来的菌株比较一下，经紫外线诱变筛选的菌株透明圈直径和直线宽度比出发菌株大，酶活显 著提高。同时通过试验确定了降解黄原胶黏度的最佳作用时间。

3. 3从平板选择性筛选得到降解黄原胶的放线菌，虽然工作量大，黄原胶降解菌的筛选及诱变选育，但是方案可行;通过物理、化学方法 进行菌种的诱变选育，也可以得到酶活显著提高的突变菌种，但是如何保持突变菌种的遗传稳定性以及 以提高降解酶酶活为目的进行发酵工艺的优化是今后研究的重点和难点问题。