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一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化

发布日期:2015-06-02 11:30:17
木质纤维是自然界最丰富的可再生资源,占整个植物细胞千重的90%以上。不同植物中木质纤维素酶各种组分的含量是不同的,软木中的木质素 含量比硬木高,草中的纤维素含量最高。一般来说, 木质纤维素中含纤维素45%、半纤维素30%和木 质素25%[1]。其中含量最高的纤维素必须通过纤维 素酶的作用分解成还原糖的形式方可用于乙醇发 酵等领域[2]。然而,就目前国内外研究现状,纤 维素酶活力不高是限制木质纤维资源利用的主要 因素[3],所以选育高产纤维素酶的菌种是关键所在。 产纤维素酶的生物种群十分广泛,如细菌、真菌、 放线菌及昆虫、软体动物和原生动物等,而目前 主要是利用细菌、真菌和放线菌等微生物发酵来 获得纤维素酶[4]。细菌类包括纤维黏菌属、纤维 杆菌属和芽孢杆菌属等;放线菌包括链霉属、高 温放线菌属和弯曲热单胞菌等;真菌类包括木霉
属、曲霉属、青霉属、漆斑霉属、孢霉属等[5]。 本研究从自然界筛选得到一株高产纤维素酶的真 菌,经鉴定为镰刀菌属,拓宽了产纤维素酶的真 菌属种,为木质纤维的降解提供了参考。
1材料方法
1.1实验材料 1.1.1样品
采集地点为湖北省神农架保护区,具体采样 地点包括大龙潭、鸭子口、板壁岩等地,样品均 为森林腐质土壤。稻草粉,收集长沙县脱谷稻草 秸秆,剪成3 cm片段,烘干后用微型植物粉碎机 粉碎至30〜120目。
1.1.2培养基
cmc-Na 培养基:CMC-Nal5g,NH4N03 lg,酵母膏 lg,MgSO4_7H2O0.5g,KH2P04lg, 去离子H20 1 000 mL,琼脂2%, pH自然。②刚 果红纤维素鉴定培养基:(NH4)2SO40.2%,MgS04 ■7H20 0.05%, K2HP〇4〇.1%, NaCl 0.05%, CMC- Na2.0%g,刚果红 0.02%,琼脂 2.0%, pH 自然。 ③滤纸液体培养基:滤纸2 g, NH4N03 1 g,酵母 膏 1 g, MgS04,7H20 0.5 g, KH2P04 1 g,去离子 H20 250 ml。④液体产酶鉴定培养基[<s]:蛋白胨3 g, 酵母膏 0.2g,(NH4)2S042 g,KH2P044 g,CaCl2 •2H20 0.3 g, MgS04-7H20 0.3 g, CMC-Na 10 g, 去离子H20 1 000 mL, pH自然。⑤种子培养基: 葡萄糖20 g/L,蛋白胨1 g/L, Mandels营养盐浓 缩液100 ml/L, Mandels微量元素浓缩液1 ml/L,
1 mol柠檬酸缓冲液50 ml/L。
1.2分析方法
1.2.1初筛方法
利用CMC-Na培养基获得纯菌落,用1 mg/ mL的刚果红溶液染色30min[7],再用蒸馏水清 洗,最后用1 mol/L的NaCl溶液脱色30 min。以 透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的 标准,将筛选到的菌株接种到滤纸液体培养基中, 28°C, 180r/min,以不接种住何菌株的滤纸液体 培养基作为空白对照,重复3次实验,以滤纸的 失重率作为筛选的标准,XKw-wO/w,其中w 为最初滤纸质量,降解后滤纸经烘干后的质量。 1.2.2复筛方法
将初筛得到的几株菌按5%的接种量接种到液 体产酶培养基中,28°C, 180 r/min,振荡培养5天后, 将培养液4 000 r/min离心10 min,取其上清液测
定酶活(FPA酶活、CMC酶活)大小。
1.2.3酶活测定[8]
FPA酶活:取四支试管,将裁剪成50±0.5 mg滤纸条折成M形沿竖直方向推到试管底部,加 入0.05 mol pH4.8柠檬酸缓冲液1.5 mL,待测酶液 0.5mL (空白管不加),充分混匀后于50°C水浴 放置60 min,迅速向各管加入DNS试剂3 mL, 空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 mim冷却 后定容至25mL,用空白管调零,540nm测定0D 值,以吸光度平均值查标准曲线计算还原糖含量。
CMC酶活:取4支试管,分别加入用0.05 mol pH4.8柠檬酸缓冲液配置的CMC-Na液2 mL,待测酶液0.5mL (空白管不加),充分混匀 后于50°C水浴放置30 min,迅速向各管加入DNS 试剂3 mL,空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 min,冷却后定容至25 mL,用空白管调零,540 nm测定OD值,以吸光度平均值查标准曲线计算 还原糖含量。
上述酶活测定,反应后均用DNS法测定酶解 产生的还原糖量,酶活单位采用国际单位,lmL 酶液1 min分解底物生成1 nmol葡萄糖的酶量定 义为1个酶活单位,以IU/mL表示。
1.2.4形态鉴定
将菌株接种到PDA平板上,培养3天,观察 菌落的特征。在平板上挑菌体少许,涂于载玻片上, 乳酸石碳酸棉兰染色液染色后置于显微镜下观察 (水浸片法),参照《真菌鉴定手册》[9]进行菌 种鉴定。
1.2.5 18SrDNA序列鉴定
100 mg菌丝样品于液氮中研磨至粉末,保存 于1 mL离心管中[1°]。利用酵母总DNA提取试剂 盒(天根生化科技有限公司)提取菌株总DNA, 采用 ITS 1 (5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG- 3,)和 ITS4 (5’-TCCT CGCC TTAT TGAT ATGC- 3')弓丨物扩增菌株18SrDNA转录间隔区[11]。PCR 反应体系为50 pL,程序为:94°C预变性5 min, 94。(:变性5〇8,51°(:退火5〇8,72°(:延伸2 111111, 30个循环,最后72°C延伸10 min。扩增产物经琼 脂糖电泳检测后送北京六合华大基因公司测序, 于NCBI数据库Blast比对分析。
1.2.6产酶条件的优化
首先进行产酶培养基单@素试验,保持培养 基中其他成分不变,分别改变其中的碳源、氮源、 初始pH和表面活性剂(鼠李糖脂)[12]这4个因素, 筛选出影响B-5菌株产纤维素酶的最佳单因素。 然后设计4因素3水平正交试验[13],确定产纤维
120
陆晨,等:一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化
第6期
素酶的最优组合。
2结果与分析
2.1初筛结果
利用CMC-Na培养基分离得到9株形态不同 菌种,有细菌、放线菌和真菌。刚果红染色,均 产生大小不一水解圈,其中B-5菌株水解圈直径 与菌落直径比值并不是最大,见图1。将分离得到 9株菌接种到滤纸液体培养基培养3d后,测定滤 纸失重率,其中接种B-5的培养基中滤纸条被崩 解成不规则小片,整个培养基成糊状,见图2,滤 纸失重率为最大,达37.9%»
表1各菌株酶活大小
Table 1 Cellulase activity of each strain IU/mL
菌株A-lA-2A-3A-4B-lB-2B-3B-4B-5
FPase1.330.890.561.140.610.731.061.152.09
CMCase3.841.560.782.450.591.062.141.185.20
2.3形态鉴定
PDA培养基28°C条件下培养4天后菌落直径 达到3 cm左右,菌落起初呈粉白色,4°C保藏10 天后局部呈淡黄色,见图3。菌落表面附着孢子, 绒毛状。显微镜下观察,菌丝缠绕抱团,由单细 胞链接而成,见图4。通过菌落和菌丝特征,推测 其为一株真菌。
 
2.2复筛结果
对于以上9株菌均进行了产酶实验,它们的 FPA酶活和CMC酶活见表1,可见B-5的FPA酶 活和CMC酶活均最高。
获得B-5菌总DNA模板后,利用ITS引物在 4个退火温度梯度下(51X:、53T、551、57X:) 进行PCR反应,均得到目的扩增产物,大小700 bp左右,见图5»测序拼接后登陆Genebank进行 Blast比对,确定其为镰刀菌属,与木贼镰刀菌同 源性达99%»
2.5 B-5镰刀菌产酶条件的优化
2.5.1不同碳源对产酶活力的影响
由图6可见,利用CMC-Na为唯一碳源时, FPA酶活和CMC酶活均最高(2.09 IU/mL和5.20 IU/mL),但稻草秸秆是天然可再生资源,并且作 为农业废物利用率较低,在实际应用方面具有优
势,故选取稻草作为唯一碳源进行产酶条件优化。 2.5.2稻草添加量对FPA酶活力的影响
由图7可见,当稻草添加量在0.5%〜2.5% 之间时,随着稻草添加量的增加,酶活不断升高。 当稻草添加量为2.5%时,FPA酶活最高为1.841 IU/mL.
2.5.3蛋白胨添加量对FPA酶活力的影响
由图8可见,当蛋白胨添加量在02%〜0.8%之 间时,随着蛋白胨添加量的增加,酶活不断升高。当 蛋白胨添加量为0.8%时,酶活最高为1.863 IU/mL。 2.5.4初始pH值对FPA酶活力的影响
保持培养基营养成分不变,当培养基的初始 pH值在酸性环境下逐渐升高时,酶活也不断升高。 当初始pH值为6.1时FPA最高为1.875 IU/mL, 见图9。
2.5.5表面活性剂对FPA酶活力的影响
保持培养基营养成分不变,分别添加〇%、 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 的鼠李糖月旨(购 买的制剂,鼠李糖脂含量为50%〜60%)。当鼠 李糖脂添加量为0.1%时,FPA酶活最高为2.067 IU/mL,见图 10。
图6不同碳源对FPA_活力和CMC酶活力的影响 Fig.6 Effects of different carbon sources on FPase and CMCase
以.5.0.5 jl.1..0.
(--1)/胺谧
.0.5.0.5 2.1.L0.
(Ils.m)/ifi«
 
图7不同稻萆添加量对FPA酶活力的影响 Fig.7 Effects of different rice straw content on FPase
〇.%.00.20.40.6- 0.81.01.21.4
蛋内胨添加量
图8不同蛋白胨添加量对FPA酶活力的影响 Fig.8 Effects of different amount of peptone on FPase
("?31)/餌避
-,15*01)/餌谳
°'3.03.54.04.55.05.56.06.57.0
初始pH值
图9不同初始pH值对FPA酶活力的影响 Fig.9 Effects of different initial pH value on FPase
2.5.6产酶培养基优化实验
在以上单因素实验的基础上,选取培养基初 始pH、氮源(蛋白胨)、碳源(稻草)和表面活 性剂(鼠李糖脂)这四个因素作为B-5镰刀菌产酶 过程中培养基优化的因素,设计四因素三水平的 正交试验如表2,试验结果见表3。
表2正交试验设计
Table 2 Orthogonal experimental design
水平因素
初始pH值氮源p/%碳源p/%表面活性剂P/%
14.80.620.1
25.50.82.50.2
36.11.03.00.3
表3正交试验结果 Table 3 Orthogonal test results
因素初始pH值氮源
p/%碳源
p/%表面活性剂
p/%酶活
/(IU-mL-1)
111111,257
212221.859
313331.791
421231.675
522312.042
623121.605
731321.562
832131.831
933212.205
4.9074.4944.6935.504
K25.3225/7325.7395.026
5.5985.6015.3955.297
R0.6911.2381.0460.478
各因素对FPA酶活影响的大小顺序为氮源> 碳源 > 初始pH值> 表面活性剂。从试验结果中得 出最优组合:初始pH为6.1,氮源浓度为1.0%, 碳源浓度为2.5%,鼠李糖脂添加量为0.1%,酶活 最高为 2.205 IU/mL。
° 0.00.10.20.30.40.50.6
鼠李糖脂添加量
图10不同鼠李糖脂添加量对FPA酶活力的影响 Fig.10 Effects of different rhamnolipid content on FPase
3结论
本研究从原始的自然环境采集样品,利用刚 果红染色和滤纸崩解等基础方法分离筛选出产纤 维素酶的菌种9株。鉴于细菌、放线菌和真菌的 生长形式不同,刚果红染色产生水解圈的大小并 不能作为其产纤维素酶活力高低的唯一标准,于 是利用滤纸的崩解效率进行反复验证。最后精确 测定FPA酶活和CMC酶活确定产酶最优的菌种 B-5。菌种鉴定时,首先通过观察菌落形态和菌 丝结构基本确定其为一株真菌,然后利用酵母总 DNA提取试剂盒提取其总DNA作为模板,通过 ITS1和ITS4引物扩增其18SrDNA转录间隔区, 在NCBI数据库中进行Blast比对确定其为一株镰 刀菌。在产酶优化实验中,将FPA酶活力(全酶活) 大小作为唯一标准,确定最优产酶培养基:稻草 粉末 25g/L,蛋白胨 10g/L, KH2P042g/L, CaCl2 •2H20 0.4 g/L, MgS04-7H20 0.02 g/L, Mandels 微量元素浓缩液1 mL/L, 1 mol柠檬酸缓冲液50 mL/L,鼠李糖脂添加量0.1%, pH为6.1。FPA酶活 为 2.205 IU/mL,相应 CMC 酶活为 5.174 IU/mL»
镰刀菌通常作为植物甚至农作物的致病菌进 行研究[14],在原始森林中筛选出的B-5镰刀菌具 有较高产纤维素酶能力,利用稻草作为碳源时有 良好的产纤维素酶效果。虽然酶活离预期还有一 段距离[15],但是通过其它的条件优化仍有提高潜 力,本研究不仅拓宽了产纤维素酶的菌谱,也为 寻求稻草秸秆新的利用途径做出了贡献。