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紫外线诱变高产黄原胶菌株

发布日期:2015-05-17 14:22:30
黄单胞菌
黄原胶是野油菜黄单孢菌以碳水化合物为主要原料,经好氧 发酵生物工程技术发酵生产的一种用途广泛的细菌胞黄单胞菌多糖,在 化工、食品医药、纺织、采油和化妆品等领域中广泛应用,是 目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖[1]。紫外 线是一种使用最早、沿用最久且应用效果明显的微生物诱变剂, 其诱变频率高,迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂 之一。本论文旨在通过对黄单胞菌紫外线诱变及紫外线-亚硝 酸钠复合诱变,筛选获得黄原胶产量较高和质量较好的菌株,为 产黄原胶菌株的进一步研究和应用提供参考。
 
1实验材料方法1.1菌株本实验室保存的Xcc8004野油菜黄单胞菌菌株。本实验室从 各地采集的野油菜黄单胞菌野生菌株cam26-cam47。
 
1.2培养基1.2.1 NYGA培养基(100ML) 酵母浸膏0.3g,牛肉浸膏0.5g, 蔗糖2g,琼脂粉1.5g,pH7.01.2.2 NYGB培养基(100ML) 酵母浸膏0.3g,牛肉浸膏0.5g, 蔗糖 2g, pH7.01.3出发菌株的筛选将菌株活化,接人装有10ml灭菌NYGB培养基的指形瓶中, 28°C,200rpm摇床培养16小时。取菌液稀释到10-5、10-6、10-7 三个浓度,用移液枪分别吸取100微升,均匀涂布在NYGA培养基 平板上,每个浓度涂两个平板。28C恒温培养箱中培养5天,观 察平板上单菌落的形态,用游标卡尺测量单菌落的直径,从每个 平板中选出最大的1个单菌落,测量其直径、记录、保藏。对来 自同一个菌株的菌落所得各新菌株,在同一平板上点板,培养5天, 观察、测量单菌落的直径,从中选出菌落直径最大的菌株,作为 该野生菌株的标准菌株。将不同野生菌株的标准菌株在同一平板 上点板,培养5天,观察平板上单菌落的形态、测量单菌落的直径, 进行菌株间对比,确定诱变出发菌株。
 
1.4不同强度的紫外线诱变分别吸取培养16小时的菌液2ml置于三个无菌平皿中,开盖, 不同距离,15W紫外灯下照射40S。诱变后的菌液10-5、10-6、10-7 稀释涂平板,各涂两个平板,28C恒温培养3天,观察平板上单 菌落的形态、计菌落数,从每个平板中选出较大的若干个单菌落, 测量其直径、记录、编号保藏。
 
1.5不同时间的紫外线诱变分别吸取培养16小时的菌液2ml置于三个无菌平皿中,开 盖,用15W的紫外灯在40cm距离下分别照射不同时间。诱变后处理同上。
 
1.6紫外线-亚硝酸钠复合诱变取培养16小时的2ml菌液放人灭菌指形瓶中,用醋酸溶液调 节pH到4.5,加人等体积的0.07mol/L的亚硝酸钠溶液,在28C 水浴中处理120S,调节pH到7.0,再置于无菌平皿中、开盖,在 15W紫外灯下40cm距离处照射40S。诱变后处理同上。
 
诱变所得菌株的初筛:从每一个诱变处理的6个平板中,观 察各个平板中菌落形状较大、菌落比较饱满光滑的菌落,选择较 大的几个菌落测量其直径大小,挑选出菌落直径最大的1个菌株, 点平板;将6个平板中各平板的直径最大菌落的菌株都点接在同 一个NYGA平板上,28C培养5天,从该平板中选出直径最大菌落 的1个菌株,培养、编号保存。
 
诱变所得菌株的复筛:将初筛得到的菌株分批进行复筛,一 批取7-8个菌株点接在同一个NYGA平板上,28C培养5天,观察、 测量各菌落直径,进行比较。选取直径最大的2个菌落的菌株, 培养、保存。对各批复筛所得菌株按上述方法进行二次复筛、三 次复筛、多次复筛;直至选出几株直径较大菌落的菌株。
 
1.7侯选菌株的发酵培养1.7.1种子液摇瓶培养从所选菌落中挑取少量菌苔于含10mlNYGB 培养基的指形瓶中,28C,200rpm摇床培养16h。
 
1.7.2摇瓶发酵取经过夜培养的菌液2.5ml接人含100mlNYGB培 养基的三角瓶中,28C,180rpm摇床培养4天。
 
1.8黄原胶的提取用移液枪吸取20ml发酵液置于50ml离心管中,在4C, 10000rpm条件下离心30min。将离心后的上清液倒人烧杯中,加 人3-7倍体积的95%乙醇,用玻璃棒搅拌,在搅拌过程中上清液 会产生絮状凝聚物,带絮状物聚集完后取出放在干净的平皿上。 剩余的液体通过滤纸过滤,将上清液中剩余的沉淀过滤出来,把 滤纸上的絮状物转移到平皿上。用乙醇多次洗涤絮状物,然后把 装有絮状物的平皿放人40C烘箱中烘干,当平皿的重量不变时, 把干燥的黄原胶粉末刮下,称量其重量。
 
2实验结果与分析2.1出发菌株的筛选出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节,长期育种的经 验证明,在诱变处理前下功夫选择一株好的出发菌株是很重要的[2]。本实验将22株野生黄单胞菌菌株分别进行平板涂布筛选,测 量长出的单菌落直径,每个平板上选出直径最大的菌落点板培养, 五天后观察生长情况,经多批、多次反复点板培养对比,将各菌 株最大单菌落的直径列于表1。
 
表1黄单胞菌各菌株最大单菌落的直径(mm)
 
菌株最大直径菌株最大直径菌株最大直径菌株最大直径cam262.76cam329.3cam387.86cam4413.3cam275.54cam3310.46cam398.54cam4514.6cam2813.94cam346.72cam4012.86cam4614. 16cam299.1cam356.2cam418.52cam4710.6cam3011.48cam365.56cam4213.24cam314.08cam379.22cam4310.42. 5诱变菌株的对比取各批次诱变所得菌落直径最大的7株菌株重新编号为 46-1、46-2、46-3、46-4、46-5、46-6、46-7 (平板上简写为:1、 2、3、4、5、6、7),点在同一个平板上,以便于菌株间的对比, 培养三天后生长情况如图1。
 
诱变的出发菌株的选择,主要考虑生长速度快(意味着发酵 生产成本低),菌胶团大(意味着黄原胶产量高)两方面。从表 1可见,cam45菌株菌落直径最大,cam46菌株菌落直径第二大; 在观察菌落形态时发现,cam46菌株菌落的菌胶团比cam45菌株 菌落的菌胶团大一些;考虑到cam46菌株与cam45菌株菌落直径 相差不大,而cam46菌株的菌胶团较大;故选择cam46号菌株作 为诱变育种的出发菌株。
 
2 2不同照射时间下黄单胞菌的紫外线诱变取cam46菌株作为出发菌株,进行诱变育种。本实验釆用紫 外线照射的方法进行诱变育种,由于紫外线的穿透能力不强,不 能穿透培养皿的皿盖,故诱变时须打开培养皿在紫外灯下照射, 照射距离为40cm,各试验组分别照射40S,80S,120S,诱变后结 果见表2。根据前人的研究经验,紫外线照射的致死率在70%左 右时,产生正突变的几率较高,有利于进一步筛选[3],故选择致 死率为69.6%的照射时间80S为最佳紫外线照射时间。
 
表2不同照射时间的致死率处理时间(S)存活菌落数(个/ml)存活率(%)致死率(%)
 
405.33X10838.661.4804.20X10830.469.61202.47X10817.982.1对照组1.38X10910002.3不同照射强度下黄单胞菌的紫外线诱变紫外线照射强度与照射距离的平方成正比关系,本实验直接 用不同的照射距离来代表不同的照射强度。取cam46菌株培养后, 打开培养皿在紫外灯下分别照射80S,设置的照射距离为20cm、 30cm、 40cm, 诱变后结果见表 3。
 
图1诱变所得菌株初次点板对比根据图1的菌株生长情况,淘汰生长速度慢、菌落明显偏小 的46-5菌株,取其他菌株同时进行摇瓶发酵,测定其黄原胶产量。 2.6黄原胶发酵与产率的计算取 46-1、46-2、46-3、46-4、46-6、46-7 菌株和 Xcc8004 标 准菌株及46号出发菌株一起发酵,经16小时液体种子培养后, 在每100mlNYGB培养基中接种2.5ml种子培养基,28°C,180rpm 条件下在摇床中培养四天。
 
取20ml发酵液置于离心管中,10000rpm离心30min,除去沉 淀后,上清液加人3-7倍体积的95%乙醇,用玻璃棒搅拌,等絮 状沉淀不再增多后,把玻璃棒上的沉淀取下放在干净的培养皿中, 发酵液通过滤纸过滤,将沉淀出来的黄原胶用乙醇洗涤后放人烘 箱中烘干至恒重,称量其干重。Xcc8004及诱变育种所得菌株产 胶率见表 5。
 
表3不同照射距离的致死率距离(cm)存活菌落数(个/ml)存活率(%)致死率(%)
 
202.39X10820.379.7303.41X10828.971.1403.94X10833.466.6对照组1.18X1091000表 5 各菌株黄原胶产量菌株产胶量(g/L)菌株产胶量(g/L)
 
Xcc80040.446-32.01Cam462.246-42.0546-11.546-6146-21.0346-72.332.4黄单胞菌的紫外线-亚硝酸钠复合诱变育种亚硝酸钠诱变作用PH为4.5,终止反应时PH为6.8 [4],进 行紫外线-亚硝酸钠复合诱变复合诱变时,先对菌种进行亚硝酸 钠诱变,亚硝酸钠处理时间120S,然后将PH调至7.0终止反应, 再取2ml亚硝酸钠处理后菌液进行紫外诱变,紫外线照射时间 40S,距离40cm,复合诱变后结果见4。
 
从上表中可以看出,黄原胶产量最高的46-7菌株产量为 2.33g/L,比出发菌株黄原胶产量增加了 0.13g/L,增产幅度为 5.9%;与本室保存的Xcc8004标准菌株相比,46-7菌株的黄原胶 产量提高了 4.8倍。
 
3小结和讨论本文以本实验室从野外分离出的一批黄单胞菌菌株为原始 菌株,釆用多次平板涂布方法分离出生长较快的菌株,再经过 多次复筛,最终选择生长较快且透明圈较大的cam46号菌株作 为诱变的出发菌株。论文釆用紫外线诱变和紫外线-亚硝酸钠 复合诱变,通过不同照射时间、不同照射距离来改变紫外线照 射的强度和剂量,并用紫外线和亚硝酸钠同时作用的方法提高 黄单胞菌的突变率。
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