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一种可降解黄原胶的鞘氨醇单胞菌的凝集活性

发布日期:2015-04-22 10:58:22
鞘氨醇单胞菌
  鞘氨醇单胞菌XT-11 Sphingomonas sp.是一种新发现的可专一性降解黄原胶的细菌[1],具有一 定的工业应用前景。关于细菌可以凝集红细胞的研究已有报道,如Brucella sp.是一种革兰氏阴性菌, 它可以凝集人血红细胞,可使哺乳动物和人传染上地中海热并导致死亡[2]。另一种革兰氏阴性菌人 胃幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori也可凝集人血红细胞[3]。红细胞凝集活性测试方法广泛用于鉴定一 些细菌致病过程中的“锁钥”结构。动物红细胞的表面存在着各种各样的糖蛋白和糖脂,因而使其 成为一种用于鉴别细菌粘附类型的工具[4]。本试验中,笔者采用血凝试验和血凝糖抑制试验,测定 了鞘氨醇单胞菌XT-11菌悬液对人和动物红细胞的凝集活性,以及温度、pH及Ca2+对菌悬液凝集 活性的影响,旨在了解该细菌的粘附类型,为深入开展细菌凝集素分子水平的研究提供依据。
  
  1材料和方法1.1材料试验用菌种系从大连湾滩涂中分离得到的,为兼性厌氧菌。人的B型血样和小鼠由大连医科大 学提供,动物血样取自大连市长兴农贸市场。试剂黄原胶、酵母浸出粉、琼脂粉、蛋白胨、胰蛋白酶 均为美国Sigma公司的产品,其它试剂均为国产分析纯。
  
  1.2方法1.2. 1 TBS红细胞悬浮液的制备血样均取全血,用38 g/L的枸橼酸钠溶液抗凝,各抗凝血经2 000 r/min离心10 min除去血楽,加入10倍体积的TBS溶液充分洗潘,然后离心3 min (1 000 r/min), 去上清液,重复4次。最后以2 500 r/min离心3 min,一部分配成2% (体积分数,下同)的TBS - Ca2+红细胞悬浮液;另一部分配成不含Ca2+的2%的TBS红细胞悬浮液。
  
  将红细胞悬浮于10以[的?83中,加入2以8胰蛋白酶,在37丈下消化1.5 1。然后用?88液清 洗3次,在TBS中配成2%的红细胞悬浮液。
  
  1.2.2菌悬液的制备将菌种接种于黄原胶固体培养基上,于恒温培养箱(30C)中培养1~2d, 待新生菌体长出后,用 TBS-Ca2+溶液(TBS: 0. 14 m〇I/L NaCI,0.01 moi/LTris-HCI,pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含0.01 m〇I/L CaCI2,pH=7. 4)清洗菌落制成菌悬液。
  
  黄原胶固体培养基的组成为:琼脂粉2%,蛋白胨0.1%,酵母浸出粉0.1%,黄原胶0.3%,葡 萄糖0.2 %,水97. 3% (均为质量分数)。
  
  1.2.3血凝活力的测定活力测定在96孔U型微量血凝板中进行。每孔中先加入25 !L的TBS - Ca2+溶液,再往第1孔中加入25 !L样品,混匀后,再从第1孔中吸取25 !L上述混合液加入到第2 孔中,以此类推作倍比稀释,最后在每孔中加入25 !L体积分数为2%的TBS-Ca2+红细胞悬浮液, 振荡摇匀,在室温下放置1~2h后,肉眼观察。若红细胞不发生凝集,则其在“U”型血凝板小孔 内沉于孔底并形成一界线清晰的红色小点;若发生凝集,红细胞之间则形成一似网络扩散的红斑块。 以有红细胞凝集活力的最大稀释度为该凝集素样品的凝集活力(凝集效价),记为2n,以TBS-Ca2 + 作空白对照。
  
  1.2.4糖的抑制试验选取16种单糖、寡糖和糖蛋白,分别制成浓度为200 mm〇l/L的溶液。往每 一孔中加入25 !L糖溶液,然后加入25 !L菌悬液,再加入25 !L体积分数为2%的兔红细胞-TBS -Ca2 +悬浮液,在室温下静置2 h后,检查凝集情况。
  
  1.2.5热稳定性的测定将菌悬液样品分别在冰箱(4°C)及温度为20、30、37、40、50、60C的恒温水浴中处理30 min,测定各样品的凝集活力。
  
  1.2. 6 pH的影响试验用HAc-NaAc缓冲液(pH为4~6)、Tris-HCl缓冲液(pH为7~9)和 Gly-NaOH 缓冲液(pH 为 10 ~ 11)将血细胞溶液的 pH 值调至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,加入菌悬液,混匀后在冰箱(4C)中放置2 h,然后将各溶液透析,使其pH值为7. 4,测定 各样品的凝集活力。
  
  1.2.7 Ca2 +影响的测定取菌悬液25!L,在96孔U型板中与等量的TBS-Ca2+溶液经系列倍比稀 释后,每孔中分别加入25 !L的10、20、40 mm〇l/L的EDTA溶液,用2%的兔红细胞-TBS悬浮液 检测其活性。对照组用TBS -Ca2+溶液作倍比稀释,用2%的兔红细胞-TBS - Ca2+悬浮液检测其活性。
  
  1. 2. 8鞘氨醇单胞菌XT -11的粗提蛋白对血凝活性的影响将鞘氨醇单胞菌XT -11在KS -250型 超声波细胞粉碎机上粉碎20 min,用含0. 15 m〇l/L NaCl的TBS溶液在4C下抽提过夜。以5 000 r/min离心20 min,取上清液。加入硫酸铵并使其含量达到70%。再以5 000 r/min离心20 min,收集 沉淀物,溶于含0. 15m〇l/LNaCl的TBS溶液中,在此缓冲液中透析除去硫酸铵。测定其血凝活性。
  
  2结果2.1菌株的鉴定菌株XT-11经革兰氏染色为阴性,抗酸性染色为阴性。电镜下可见幼龄时期的菌株为杆菌,菌 体大小为(0.4~0.6) !mx (1.0~2.0 ) !m,但经过一周以上的培养后,菌体呈类球状细胞(0.5 !mx0.5!m),不运动,不形成芽孢,有鞭毛。
  
  该菌株只能在低于40 g/L的NaCl浓度下生长,可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半 乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纤维二糖和D -岩藻糖等多种糖类基质,但不产酸不产气;氧化酶反应为阴性,过氧化氢酶反应为阳性,不呈现卵 磷脂酶和脲酶活性;不能水解淀粉、纤维素、七叶苷、酪素、明胶和油脂等,但能分解果胶;甲基红 试验为阳性,石蕊牛奶反应为暗红色产酸;能够由色氨酸生成吲哚并且能够产生硫化氢;硝酸盐还原 呈阴性反应。对半乳糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化发酵试验发现,该菌对上述各种糖均属发酵型代 谢。该菌不能利用柠檬酸盐,在以葡萄糖为唯一碳源和氮源的培养基上不能生长。根据菌体的形态、 运动性以及生理生化性质,参照《伯杰细菌鉴定手册》,初步鉴定该菌属于鞘氨醇单胞菌属Sphin-go漏肠 sp. [1]。
  
  2.2菌悬液对血细胞的凝集作用用XT-11菌悬液对人的B型血及家兔、家鸡、家鸽、小鼠4种动物红细胞的凝集效价进行了试 验,结果表明,鞘氨醇单胞菌XT-ll菌悬液对家兔的红细胞凝集作用最强,凝集效价为26;对家鸡 的凝集作用次之,为24;它不凝集小鼠和家鸽的红细胞,也不凝集人的B型红细胞以及经胰蛋白酶 处理后的人的B型红细胞。
  
  2. 3糖抑制作用用半乳糖、肝素、甘露糖、D (-)核糖、N-乙酰半乳糖酰胺、粘蛋白、N-乙酰葡萄糖酰胺、 去唾液酸粘蛋白、岩藻糖、硫酸软骨素、葡萄糖、!-氮苯基-a-D-吡喃(型)半乳糖、麦芽糖、 D (+)氯水合葡萄糖胺、乳糖、猪甲状腺球蛋白共16种糖对菌悬液凝集兔红细胞的影响试验表明, 只有肝素可抑制菌悬液对兔血红细胞的凝集作用,是否还有其它糖类可以抑制菌悬液对兔血红细胞的 凝集作用,有待于进一步证明。
  
  2. 4热稳定性XT-11菌悬液血凝集的热稳定性试验结果见图1。由图1可见,菌悬液在4C时的血凝集效价最 高,为26;随着温度的升高,其凝血活性逐渐下降;当温度达到60°C时,菌悬液丧失血凝集活性。 这表明该菌的血凝集活性为热敏感型。
  
  2.5 pH对血凝活力的影响XT -11菌悬液在不同pH值的凝集反应试验结果表明,菌悬液中的凝集素对pH的变化比较敏感 (图2)。本试验中,pH低于5或高于10时,兔红细胞发生全部或部分溶血现象,因此,该结果没有 统计。但从图2可见,当pH为6. 0 ~10. 0时,菌悬液的凝集活性相对稳定。
  
  2. 6 Ca2+对血凝活力的影响在反应体系中,加入和不加入EDTA溶液,菌悬液的血凝集活性没有任何变化,这表明XT-11 菌悬液的血凝活性不受EDTA的影响,不依赖于Ca2+的存在。
  
  2. 7鞘氨醇单胞菌XT -11的粗提蛋白对血凝活性的影响鞘氨醇单胞菌XT-11的蛋白样物质经硫酸铵盐析、TBS溶解蛋白沉淀、透析脱盐后,获得的粗 提蛋白溶液,仍然具有血凝活性。
  
  3讨论近年来,对微生物凝集素的研究已成为一个新的热点,其原因有以下几方面:一是微生物学研究 的需要。微生物凝集素是微生物长期进化发展的结果,一些微生物通过对宿主感染来发展自己,如沙 门氏菌、链球菌、弧菌和拟杆菌等,它们的凝集素是感染动物宿主细胞的关键因素。二是微生物凝集 素在介导各种生理和病理过程中起着重要作用,在最新一代抗生素的研究中,多以微生物凝集素作为 新的药物作用靶点。三是微生物凝集素广泛应用于生化研究中。
  
  一些携有凝集素的细菌可以很容易地结合吞噬细胞,如人的多形核白细胞和鼠的腹膜巨噬细胞可 以借助于其细胞表面的菌毛等发状附器完成此过程。菌毛(又称纤毛、伞毛、线毛或须毛)是一种 长在细菌体表的纤细、中空、短直且数量较多的蛋白质类附属物,具有使菌体附着于物体表面上的功 能,直接着生于细胞质膜上,直径一般为3 ~10nm,每个菌体一般有250 ~300条菌毛。革兰氏阴性 致病菌借助菌毛使自己牢固地黏附在宿主粘膜上[5]。这些蛋白质类附属物具有凝集红细胞的作用。
  
  本试验结果表明,鞘氨醇单胞菌XT-11对红细胞的凝集行为具有兔血红细胞特异性。进一步用 硫酸铵盐析法提取鞘氨醇单胞菌XT-11中的蛋白样物质,证实它具有血凝活性。因此,可以说,在 鞘氨醇单胞菌XT-11表面存在的这种蛋白质对兔红细胞表面存在的糖蛋白和糖脂具有选择性,且同 时是一种热敏感蛋白和pH依赖蛋白。
  
  革兰氏阴性菌Brucella sp.可以与人和动物红细胞表面存在的唾液酸残基结合,同时这种结合可 以被硫酸肝素、硫酸软骨素、N -乙酰神经氨酸和N -乙酰神经酰胺-乳糖所抑制[2]。鞘氨醇单胞菌 XT-11对红细胞的凝集活性可以被肝素所抑制,这说明它是一种具有肝素特异性的细菌凝集素。关 于肝素特异性凝集素有很多的报道。肝素和类肝素是由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸组成的一类长链多 糖,葡糖胺上存在3个方式各异的硫酸化位点,加之硫酸化程度不同,使得多糖链复杂多变。凝集素 物质与肝素作用机理是比较复杂的,这表明鞘氨醇单胞菌XT-11与肝素的作用机理也是较复杂的, 需要提纯该菌的凝集素成分,才能对其作用机理进行进一步的研究。