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自然条件下纤维素分解真菌的分离筛选

发布日期:2015-04-15 09:47:58
真菌
  纤维素类物质是地球上最丰富的天然有机物 质[1],广泛存在于自然界中,占植物界总碳含量的 50%以上。一般杂草、木材和作物秸秆等都是纤维素的丰富来源,其细胞壁化学成分主要包括纤维 素、半纤维素和木质素,其中木质素常与半纤维素 以价键结合,将纤维素分子包裹在里面,形成复杂的结构体系,因此对这类物质的降解利用十分困 难[2]。目前,利用微生物发酵产生纤维素酶,将纤维素类物质转化为人类急需的能源、食品和化工原 料,已成为纤维素类资源再生利用研究的热点[3,4]。 但迄今为止,对农作物秸秆等含纤维素类物质完全降解的高活性真菌株十分缺乏,单纯的具有高纤维素酶活的菌株对农作物秸秆、杂草和木屑等的分解利 用能力不一定高[5]。因此,分离和筛选高酶活和能 有效降解自然结构的农作物秸秆纤维素的菌种显 得尤为重要。金显春等[6]以纤维素、半纤维素及稻 草的降解率为指标,筛选得到了一株对稻草秸秆有 高降解率的菌株。郝月等[7]通过测定天然纤维素酶 活,筛选出6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力 的菌株。本试验以自然界中富含纤维素、木质素分 解菌株的腐烂枝条、朽木为材料,以纤维素培养基 结合杂草、木屑进行发酵选择培养,经过多次反复 试验比较,从分离所得的多个菌株中筛选出4株较 好的纤维素分解真菌,这对研究自然界纤维素类物 质的降解利用具有重要的意义
  
  1材料与方法1. 1试验材料湿润的半腐朽木及大部分内部已腐烂的猕猴 桃扦插枝条采自广西桂林植物园。
  
  1.2培养基①初选分离培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PSA):马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂15g,去离子水 1000mL,自然pH值。
  
  ②复选培养基:a.竣甲基纤维素钠培养基: cmc-Na 15.0g,MS无机盐,KH2PO4 1.0g; b.滤纸平 板培养基:滤纸条,MS无机盐,KH2PO41.0g; c.纤维素 刚果红培养基[8]:(NH4)2S〇4 2.0g,MgS〇4 • 7氏0 0.5g, KH2PO4 1.0g,NaCl 0.5g,CMC-Na 2.0g,刚果红0.2g。 均添加琼脂15g,去离子水1000 mL,pH=7.0。
  
  ③富集增殖培养基:a. MS无机盐,葡萄糖20g, 琼脂15g,去离子水1000mL,pH=7.0; b. MS无机盐,蔗 糖20g,去离子水1000mL,pH=7.0,琼脂15g; c.马铃 薯蔗糖琼脂培养基,去离子水1000mL,自然pH值。
  
  ④液体发酵培养基:a.赫奇逊培养基(Hechisum medium):KH2PO4 1.0g,MgSO4'7H2O 0.3g,NaCl 0.1g, CaCl2 0.1g,FeCl3 0.01g,NaNO3 2.5g; b. MS无机盐添力口 滤纸;c. MS无机盐添加CMC-Na 15.0g。均为去离子 水 1000mL,pH=7.0。
  
  ⑤固体发酵培养基:割取野外干枯的杂草,用 1%的NaOH浸泡24h后冲洗至中性,60丈干燥后剪 成2~3cm小段,去离子水湿润装瓶;取碎小木屑刨花 用1%的NaOH浸泡24h后冲洗至中性,60丈干燥后用 去离子水湿润装瓶。
  
  以上培养基均在121丈湿热灭菌30min后使用。
  
  1.3试验方法1.3.1菌株的分离筛选将采集的内部已腐烂的 枝条、朽木用自来水冲洗表面干净后,带入室内进 行表面灭菌。先放入75%酒精中浸泡60s后,用1.0g/L HgCl2溶液消毒4~6 min,无菌水冲洗5遍,将材料切 成小段后接入PSA培养基进行培养,待菌株长出后 立即进行转接,重复多次直至得到纯菌落。将所得 到的纯菌株在竣甲基纤维素钠、滤纸和刚果红培养 基上进行复筛,选出在纤维素培养基上生长快和水 解圈大的菌株,编号保存。
  
  1.3.2酶活力的测定将筛选出的菌株发酵培养 一定时间后,发酵液于3000r/min离心15min,上清液 作为粗酶液。羟甲基纤维素酶(CMCase )、滤纸纤维 素酶活力(FPase)的测定及计算参照王建[9]和李日 强等™的方法。酶活定义:以每分钟产生相当1^mol 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
  
  1.3.3还原糖及总糖含量的测定还原糖采用 DNS法测定,总糖含量采用蒽酮-硫酸法测定™。
  
  1.4数据处理试验数据采用SPSS16.0软件进行处理。
  
  2结果与分析2.1菌株的筛选2. 1. 1菌株的分离经过多代分离提纯和反复试 验筛选比较,从自然界中的腐枝、朽木中分离得到 纤维素、木质素分解真菌4株,分别标记为F-1、F-2、 F-3和F-4。各菌株在以羧甲基纤维素钠和滤纸为限 制性碳源培养基上的生长速率见表1。
  
  从表1可以看出,所分离筛选的4株真菌均能在 纤维素培养基上生长,但生长速率不同。当培养4d 时,菌株F-4在羧甲基纤维素钠和滤纸培养基上生 长无差别,直径均为5.0cm;其它菌株则以在羧甲基 纤维素钠培养基上生长较滤纸培养基快,其中以 F-2、F-3直径最大,达到6.0cm, F-1直径相对最小,但 菌丝密厚。培养8d时,菌株F-1、F-3、F-4在羧甲基纤■ 226 ■广西农业科学2009年第40卷第3期维素钠培养基上均已长满整个培养皿(培养皿直快,也已长满培养皿。观测菌丝的稀疏程度,以菌株径为9cm),而在滤纸培养基上,F-2和F-4生长最F-1最密,F-2其次,F-3、F-4菌丝较长,但十分稀疏。
  
  表1 4株真菌在纤维素为唯一碳源培养基上的生长速率 Table 1 Growth rates of four fungi on medium with cellulose asthe sole carbon source培养时间(d) 培养基菌株直径(cm) Diameter of colonyCultured time MediumF-1F-2F-3F-4羧甲基纤维素钠平板 CMC-Na screening plate 4滤纸平板Filter paper screening plate3.6±0.126.0±0.066.0±0.115.0±0.002.0±0.004.3±0.441.0±0.005.0±0.26羧甲基纤维素钠平板 CMC-Na screening plate8滤纸平板Filter paper screening plate9.0±0.006.4±0.209.0±0.009.0±0.005.0±0.159.0±0.005.0±0.109.0±0.00注:数据为3次重复的平均值±标准误。
  
  Note: Data are the average of three reduplications 士 standard error.
  
  2. 1.24株真菌产透明圈的大小及对滤纸的分解能力将4个菌株分别接种在纤维素刚果红平板培 养基和滤纸液体发酵培养基上,观测各菌株透明圈 的大小和滤纸的溃烂情况。由表2可知,在纤维素刚 果红平板培养基上,4个菌株均能产生透明圈,以 F-4透明圈直径最大,为1.47cm;各菌株对滤纸均有 较好的分解效果,以F-2、F-3对滤纸的分解效果最 好,且F-3分解速度最快。
  
  表2 4株真菌产透明圈的大小及对滤纸的分解情况 Table 2 The effects of four fungi on clear haloes and decom¬posing filter paperF-1F-2F-3F-4透明圈•二,0.67±0.03 0.93±0.03 0.67±0.07 1.47±0.03Diameter of clear haloes滤纸分解程度Extent of decomposing ++++++++++++++filter paper注:++++滤纸成均匀糊状;+++滤纸成有碎片糊状;++滤纸破裂、边缘膨胀;滤纸边缘膨胀。
  
  Note: ++++filter paper was decomposed into homogeneous paste; +++ filter paper was decomposed into slurry paste; ++ filter paper was de— composed and its edge was expanded; + the edge of filter paper was expanded2. 2不同培养基对4株真菌富集増殖的影响将4株真菌点接到以MS无机盐、分别添加蔗糖 和葡萄糖作为碳源的培养基以及PSA平板培养基上 进行培养,定期观测平板上菌落的直径大小及菌丝 稀疏情况。由表3可知,4个菌株在3种培养基上的生 长速率不同。培养2d时,在3种培养基上的启动生长 速度为F-4>F-3>F-1>F-2;菌株F-1在蔗糖培养基 上启动生长最快,F-3在PSA培养基上启动生长最 快,F-2、F-4在3种培养基上生长差别不明显。当培 养4d时,菌株F-1、F-2和F-3均以在PSA培养基上生 长最快,其中F-2菌落直径较小,但菌丝厚密,F-4以 在蔗糖培养基上菌落直径最大。当培养6d时,菌株 F-1、F-3和F-4在PSA培养基上已长满整个培养皿, 其中F-4在蔗糖培养基上也已长满整个培养皿,F-2 生长相对慢,未能长满整个培养皿,但菌丝较厚密。 综上可知,4个菌株适合的启动生长培养基各不相 同,但均以在PSA培养基上增殖生长最快,因此, PSA可用于4株真菌的富集增殖。
  
  表3 4株真菌在不同培养基上的生长情况 Table 3 The growth of four fungi on different media培养时间(d)培养基菌落直径(cm) Diameter of colonyCultured timeMediumF-1F-2F-3F-4MS+Sucrose1.1±0.030.5±0.061.4±0.122.7±0.152MS+Glucose0.6±0.200.6±0.151.5±0.372.6±0.07PSA0.8±0.130.4±0.062.4±0.072.4±0.03MS+Sucrose3.7±0.202.3±0.103.8±0.155.9±0.704MS+Glucose3.5±0.122.8±0.124.2±0.444.8±0.70PSA5.4±0.504.0±0.035.7±0.644.8±1.46MS+Sucrose5.8±0.303.0±0.105.0±0.449.0±0.006MS+Glucose6.3±0.183.8±0.175.8±0.326.3±0.09PSA9.0±0.005.1±0.039.0±0.009.0±0.002. 3不同液体发酵培养基上各菌株的产酶情况 取静置液体培养3d的各菌株上清液0.5mL分别 接种到不同的液体发酵培养基中,室温培养5d后, 取上清液作为粗酶液,测定其CMCase和FPase活 力。由表4可知,4个菌株在不同发酵培养基上培养 后所产酶液的CMCase和FPase活力不同。在无碳源 的赫奇逊液体培养基上培养后,各菌株的CMCase 活力相差不大,F-1和F-4的FPase活力略高于其他 菌株。在MS无机盐分别加入滤纸和羧甲基纤维素 钠作为碳源培养基上培养后,各菌株的酶活均有了 较大的提高,其中在滤纸培养基上,菌株F-1的CM- Case、FPase活力分别达到 199. 6U/L和 104.4U/L,明 显高于其他菌株,其他菌株之间相差不大。在以羧 甲基纤维素钠作为碳源培养基上,各菌株的CM- Case、FPase活力均有了明显提高,其中以F-1的CM- Case酶活和F-4的FPase活力最高,分别为384.4U/L 和179.7U/L。由此可见,初始培养基中添加纤维素 碳源能促进菌株产纤维素酶,且酶活高低与纤维素 种类有较大关系。
  
  表4 4株真菌在不同初始发酵培养基上的产酶活力Table 4 Enzymatic activity of four fungi on different fermentation media编号No.CMCase activity (U/L)FPase activity (U/L)
  
  abcabcF-134.5±0.05199.6±0.48384.4 ±4.5978.3±1.21104.4±0.63156.04 ±1.09F-236.1±0.12106.0±0.17189.1±0.0569.8±0.7375.3±0.58101.98±0.46F-335.1±0.05120.2±0.05308.6 ±0.2056.4±0.3573.1±0.7891.64±0.73F-434.2±0.08111.3±0.03174.5±0.1783.2±2.5575.3±0.47179.7±0.572. 4菌株在天然纤维素培养基上的生长及还原糖 和总糖含量将静置液体培养的菌株母液分别接种到已灭 菌的杂草和木屑培养基上,观测4个菌株在杂草和 木肩上繁殖生长的快慢,培养10d后测定培养基质 中还原糖和总糖的含量(表5)。结果表明,4个菌株 对杂草和木屑的降解及对产物的利用各不相同。 观察4株真菌在杂草和木屑培养基上的繁殖生长速 率,以F-3和F-1分别在杂草和木屑上的启动生长 最快,繁殖增殖速率最大。在杂草培养基上,还原 糖含量大小为F-2>F-3>CK>F-1>F-4,以F-2最高, 为1.09 mg/g;总糖含量大小为CK>F-1>F-2>F-4 > F-3,以对照最高,F-3最低。在木屑培养基上,4个菌 株发酵产物还原糖和总糖含量均明显低于对照,其 中还原糖以F-3最低,总糖以F-1最低。菌株的生长 速度与发酵产物中总糖含量大小相反,生长速率越 快,总糖含量越低。由此说明,所筛选出来的菌株能 充分利用可溶性糖作为能源物质迅速繁殖,以便有 足够的数量来启动对纤维素类物质的降解。
  
  表5发酵产物还原糖和总糖的含量及菌株的生长速率Table 5 The content of total sugar and reduced sugar in fermentation products and the growth rate of fungi编号No.还原糖含量(mg/g) Content of reduced sugar总糖含量(mg/g)
  
  Content of total sugar菌株生长快慢Growth rate of strains杂草Weeds木屑 Sawdust杂草 Weeds木屑 Sawdust杂草 Weeds木屑 SawdustCK0.64±0.010.70±0.022.52±0.141.65±0.14--F-10.43±0.010.37±0.012.38±0.120.46±0.01快 Fast快 FastF-21.09±0.080.31±0.012.30±0.070.69±0.13慢 Slow快 FastF-30.68±0.020.22±0.001.57±0.500.89±0.39快 Fast快 FastF-40.33±0.010.37±0.012.18±0.040.91±0.20慢 Slow快 Fast3结论与讨论以自然条件下腐烂的枝条、朽木为材料,结合 纤维素发酵选择培养的方法,筛选出高效稳定的纤 维素分解菌是一条有效的途径。腐烂的枝条、朽木 聚集着大量的天然纤维素降解菌群[12,13],以纤维素 培养基结合天然杂草、木肩进行发酵选择培养,可 在保证菌株的正常生长、保持菌群稳定的同时,筛 选得到能降解杂草和木屑的菌株。本试验的结果 证明该筛选方案是可行的,得到的4株真菌在具有 较高CMCase和FPase的同时,还能在单纯的杂草和 木屑上快速启动生长并大量增殖,且生长速率与产 物中总糖含量成负相关。由此可初步判断出4株真 菌分解纤维素类物质的能力都较强,可作为筛选的 一个主要依据。
  
  由于纤维素酶是一种具有不同底物特异性的 多组分酶系M,因此基于本试验结果,可以考虑将4 株真菌进行选择性的组合培养,以弥补单菌发酵产 酶的缺陷[15,16]。另外,由于本试验是在不同时期、室 温静置条件下进行的菌株培养试验,因此导致菌株 生长速率不均衡,若将这4株真菌进一步进行优化 试验,以探明其最适的生长及产酶条件,或对其进 行诱变、遗传改造,势必将更大程度提高其降解 纤维素类物质的能力,从而更好地应用生产实践。