黄原胶（xanthan gum, XG)别名黄胶、汉生 胶，又称黄单胞多糖，是20世纪50年代美国农业部 北方研究室(Northern Regional Research Laboratories, NRRL )从野油菜黄单胞菌（Xaw/Aowowas cawpes/Ws) NRRL B-1459中发现的中性水溶性多 糖，相对分子质量为2X106~2X107间。XG的流变 性[9]和黏弹性与SH近似，且不易被酸、碱、热及体 内自由基、酶降解。关节腔注射XG可起到润滑和 缓冲应力的作用，XG有可能成为治疗骨关节炎新 药。本实验在建立兔膝骨关节炎模型的基础上，通 过研究关节滑液中白介素1P (IL-1P)、肿瘤坏死因 子a (TNF-a)、前列腺素E2 (PG E2)和一氧化氮 (NO)的表达，初步探讨XG对OA的疗效。

1材料与方法 1.1动物

健康6~8月龄雄性新西兰大耳白兔26只，体重 2.5~2.8 kg (山东省医药工业研究所药物安全if价中心）。 1.2药物、主要试剂和仪器

黄原胶注射液（本实验室制备），各项参数 已符合注射液标准；黄原胶注射液对兔膝骨关节炎治疗作用的实验研究,玻璃酸钠注射液（施沛特） 20 mg/支（2 mL)，（山东博士伦福瑞达，批号 101019034); IL-1P、TNF-a和PG E2酶联免疫吸附 测定试剂盒（武汉伊艾博）；NO硝酸还原酶检测试 剂盒（南京建成）；木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸（美国 Sigma);酶标伩（美国Thereto )。

1.3动物模型的制备、分组及给药方法

参照造模方法[10]，将木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸用 生理盐水溶解至浓度分别为2 °% (w/v)和0.03 mol/L， 0.22 pm滤膜除菌过滤，作为木瓜蛋白酶混合液。将 26只兔分别在1，3, 5 d于右膝关节腔注射该混合液 0.1 mL/kg。造模后第2周随机处死2只兔用于证明造 模成功。然后将剩余的兔随机分为3组，每组8只：生 理盐水组（saline组）兔右膝关节腔注射生理盐水， 0.1 mL/kg，1次/周，连续5周；玻璃酸钠组（SH组） 兔右膝关节腔注射1 °%SH，0.1 mL/kg，1次/周，连续 5周；黄原胶组（XG组）兔在第2和4周右膝关节腔注 射1 °%XG，0.1 mL/kg，在第1，3和5周注射等量生理

盐水；所有兔左膝关节腔注射生理盐水，0.1 mL/kg，

1次/周，连续5周，作为假手术组（sham组）。治疗5 周后，在兔处于麻醉状态下，向关节腔注射0.5 mL生 理盐水，反复屈膝8次，抽取滑液0.5 mL，13 000 r/min 离心10 min，取上清-20 °C保存备用。

1.4IL-1P、TNF-a和PG E2的含量测定

取标准品加稀释液至1 mL，得到1 000 pg/mL标 准溶液。然后做系列倍比稀释，分别配制成1 000， 500, 250，125, 62.5，31.2，15.6 pg/mL，样品稀释液直 接作为空白孔0 pg/mL。然后按试剂盒说明书操作。

1.5NO的含量测定

取3组试管，为标准管、空白管和测定管，然后 按NO试剂盒的说明进行操作。

测定管吸光度-空白管吸光度一

NO含量(陣ol/L)=标准管吸光度-空白管吸光度X标 准品浓度(100^mol/L) X样品测试前稀释倍数 1.6统计学处理

采用SPSS 13.0软件统计分析。首先行正态分布 描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较 采用/检验，所得数据以i±s表示，户<0.05为在统计 学上有差异。

2结果

正常的兔关节滑液为透明、无色或浅黄色黏稠 液体，造模后的滑液为浑浊、深黄色液体。IL-1P、 TNF-a和PG E2的含量测定结果表明：与saline组比， 关节腔注射XG可显著抑制关节滑液中IL-1P、TNF-a 和PG E2的表达（尸<0.01);与SH组比，XG组的 TNF-a和PG E2含量没有显著性差异（户>0.05)， 黄原胶注射液对兔膝骨关节炎治疗作用的实验研究,但IL-1P略高于SH组（尸<0.05)(见表1)。NO 含量测定结果表明：与saline组（401.59±28.59) —ol/L 比，关节腔注射XG可显著抑制关节滑液中NO的 表达（253.01 ±27.09) pmol/L (P<0.01);但与 SH组（262.82±22.56) pmol/L比没有显著性差异 (户>0.05)(见图1)。关节腔注射XG可抑制兔膝关 节OA模型中IL-1P、TNF-a、PG E2&NO的表达，且 作用时间长。

3讨论

XG的基本结构是由重复的五糖单元组成，此单 元由2个D-葡萄糖、2个D-甘露糖和1个D-葡糖醛酸组 成。XG分子的一级结构是由P-1,4键连接的D-葡萄糖

表1各组关节滑液中IL-1P、TNF-a和PG私的含量

(赶

组别IL-1p /pg-mL"1TNF-a /pg*mL-1PG E2 /pg.mL-1

sham (n=24)12.11±1.685.29 ±1.260.00±0.00

saline (n=8)56.34±2.2621.08±1.824.98±1.36

XG (n=8)37.41 ±4.24A12.32±1.59**1.66±0.38**

SH (n=8)34.27 ±1.9212.34±1.691.62 ±0.40

*><0.01saline 组；^<0.05 vs SH 组

 

Sham Saline XG SH

图1各组关节滑液中NO的含量

*><0.01 vs saline 组

基主链与三糖单位侧链组成，其侧链由D-甘露糖和 D-葡糖醛酸交替连接而成。二级结构是侧链通过氢 键反向缠绕主链形成的双螺旋或多螺旋结构。三级结 构是二级结构通过非共价键组成的网状结构[11]。由于 XG特殊的二级结构，侧链保护主链不易使其降解， XG可能具有更高的稳定性，因此可减少关节腔给药 次数，减少患者给药不便及降低给药部位感染几率。

动物模型是研究OA病因、机制和治疗方法的重 要手段之一。兔膝关节组织结构与人类接近，其OA 模型的软骨生化指标与人类OA—致，且兔膝关节面 较宽，取材量较大，因此兔是一种理想的造模动物[12]。 所用的方法有关节制动，关节腔注射物质、关节内、 外手术等。其中，黄原胶注射液对兔膝骨关节炎治疗作用的实验研究,关节腔注射物质具有成功率高、造 模成型时间短等优点[13]。木瓜蛋白酶关节腔注射可诱 导狗、兔、豚鼠、大鼠等动物髋关节和膝关节OA, 其特点是发病速度快、重复性好、与人类OA类似[14]。 本实验采用兔膝关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸 建立OA模型，此方法简便易行，可在短期内发生OA 病变，且病变典型，过程清晰。

随着近年对OA研究的不断深入，人们发现炎 性细胞因子IL-1P、TNF-a在OA的发生发展中起到 重要的作用。IL-1P是引发滑膜炎和介导关节软骨破 坏的重要细胞因子之一。它可上调NO、环氧合酶2 (COX-2)、PG E2和基质金属蛋白酶（MMP)等与

炎症反应和软骨退变相关基因的表达，还与TNF-a等 炎性因子有协同效应，并可抑制软骨细胞合成蛋白聚 糖和II型胶原[15]。TNF-a是一种具有多种生物效应的 细胞因子，其可增强多型核细胞功能，刺激其释放 溶酶体酶；刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2、胶 原酶及蛋白酶，引起关节软骨破坏[15]。本研究结果表 明，模型组关节液中IL-1P和TNF-a显著升高，说明造 模后关节部位有炎症发生。关节腔注射XG后，可保 护关节软骨，降低IL-1P和TNF-a的含量，且5周共注 射2次与5周注射5次SH间并无显著性差异。

PGE2是一种重要的细胞生长调节因子，也是 导致滑膜炎症和关节疼痛的直接原因之一。IL-1P和 TNF-a可通过诱导前列腺素合酶-1和COX的生成来促 进PG E2的合成，而PG E2对IL-1P和TNF-a的表达也有 正反馈作用，从而进一步诱导软骨细胞凋亡[16]。NO 是一种高度反应性和细胞毒性物质，对细菌、真菌和 肿瘤细胞均有杀伤性，同时也破坏正常组织。在OA 的发生和发展中，受损裸露的软骨细胞在细胞因子的 作用下，诱发一氧化氮合酶表达，导致软骨产生大量 NO。NO还可抑制软骨细胞分泌细胞外基质和合成II 型胶原，同时激活MMP，介导细胞凋亡和软骨细胞 炎症反应[17]。本实验研究表明，模型组关节液中PG E2和NO显著升高，而XG组PG E2和NO的含量显著降 低，关节腔注射XG可抑制PGE2和NO生成，黄原胶注射液对兔膝骨关节炎治疗作用的实验研究,且5周共 注射2次与5周注射5次SH间并无显著性差异。

由于XG具有高黏弹性和稳定性，关节腔注射XG 可起到润滑和缓冲作用，进而起到保护软骨、防止 软骨降解和抑制OA进展的作用。本实验研究表明： 在木瓜蛋白酶诱导的OA模型中，与关节腔注射生理 盐水比，注射1 °% XG (2次/5周）和1 °% SH (5次/5 周）均能抑制关节滑液中IL-ip、TNF-a、PG E2及NO 的表达，且注射XG和SH在TNF-a、PG E2&NO表达 并无显著性差异，关节腔注射XG可显著抑制OA进 展，且作用时间更长。