木质纤维是自然界最丰富的可再生资源，占整个植物细胞千重的90%以上。不同植物中木质纤维素酶各种组分的含量是不同的，软木中的木质素 含量比硬木高，草中的纤维素含量最高。一般来说, 木质纤维素中含纤维素45%、半纤维素30%和木 质素25%[1]。其中含量最高的纤维素必须通过纤维 素酶的作用分解成还原糖的形式方可用于乙醇发 酵等领域[2]。然而，就目前国内外研究现状，纤 维素酶活力不高是限制木质纤维资源利用的主要 因素[3],所以选育高产纤维素酶的菌种是关键所在。 产纤维素酶的生物种群十分广泛，如细菌、真菌、 放线菌及昆虫、软体动物和原生动物等,而目前 主要是利用细菌、真菌和放线菌等微生物发酵来 获得纤维素酶[4]。细菌类包括纤维黏菌属、纤维 杆菌属和芽孢杆菌属等；放线菌包括链霉属、高 温放线菌属和弯曲热单胞菌等；真菌类包括木霉

属、曲霉属、青霉属、漆斑霉属、孢霉属等[5]。 本研究从自然界筛选得到一株高产纤维素酶的真 菌，经鉴定为镰刀菌属，拓宽了产纤维素酶的真 菌属种，为木质纤维的降解提供了参考。

1材料与方法

1.1实验材料 1.1.1样品

采集地点为湖北省神农架保护区，具体采样 地点包括大龙潭、鸭子口、板壁岩等地，样品均 为森林腐质土壤。稻草粉，收集长沙县脱谷稻草 秸秆，剪成3 cm片段，烘干后用微型植物粉碎机 粉碎至30〜120目。

1.1.2培养基

① CMC-Na 培养基：CMC-Nal5g，NH4N03 lg，酵母膏 lg，MgSO4_7H2O0.5g，KH2P04lg， 去离子H20 1 000 mL,琼脂2%, pH自然。②刚 果红纤维素鉴定培养基：（NH4)2SO40.2%，MgS04 ■7H20 0.05%, K2HP〇4〇.1%, NaCl 0.05%, CMC- Na2.0%g,刚果红 0.02%,琼脂 2.0%, pH 自然。 ③滤纸液体培养基：滤纸2 g, NH4N03 1 g,酵母 膏 1 g, MgS04,7H20 0.5 g, KH2P04 1 g,去离子 H20 250 ml。④液体产酶鉴定培养基[<s]:蛋白胨3 g， 酵母膏 0.2g，（NH4)2S042 g，KH2P044 g，CaCl2 •2H20 0.3 g, MgS04-7H20 0.3 g, CMC-Na 10 g, 去离子H20 1 000 mL, pH自然。⑤种子培养基： 葡萄糖20 g/L，蛋白胨1 g/L, Mandels营养盐浓 缩液100 ml/L, Mandels微量元素浓缩液1 ml/L，

1 mol柠檬酸缓冲液50 ml/L。

1.2分析方法

1.2.1初筛方法

利用CMC-Na培养基获得纯菌落，用1 mg/ mL的刚果红溶液染色30min[7]，再用蒸馏水清 洗，最后用1 mol/L的NaCl溶液脱色30 min。以 透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的 标准，将筛选到的菌株接种到滤纸液体培养基中， 28°C, 180r/min,以不接种住何菌株的滤纸液体 培养基作为空白对照，重复3次实验，以滤纸的 失重率作为筛选的标准，XKw-wO/w，其中w 为最初滤纸质量，降解后滤纸经烘干后的质量。 1.2.2复筛方法

将初筛得到的几株菌按5%的接种量接种到液 体产酶培养基中,28°C, 180 r/min，振荡培养5天后， 将培养液4 000 r/min离心10 min,取其上清液测

定酶活（FPA酶活、CMC酶活）大小。

1.2.3酶活测定[8]

FPA酶活：取四支试管，将裁剪成50±0.5 mg滤纸条折成M形沿竖直方向推到试管底部，加 入0.05 mol pH4.8柠檬酸缓冲液1.5 mL，待测酶液 0.5mL (空白管不加），充分混匀后于50°C水浴 放置60 min,迅速向各管加入DNS试剂3 mL, 空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 mim冷却 后定容至25mL,用空白管调零，540nm测定0D 值，以吸光度平均值查标准曲线计算还原糖含量。

CMC酶活：取4支试管，分别加入用0.05 mol pH4.8柠檬酸缓冲液配置的CMC-Na液2 mL,待测酶液0.5mL (空白管不加），充分混匀 后于50°C水浴放置30 min,迅速向各管加入DNS 试剂3 mL,空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 min，冷却后定容至25 mL,用空白管调零，540 nm测定OD值，以吸光度平均值查标准曲线计算 还原糖含量。

上述酶活测定，反应后均用DNS法测定酶解 产生的还原糖量，酶活单位采用国际单位，lmL 酶液1 min分解底物生成1 nmol葡萄糖的酶量定 义为1个酶活单位，以IU/mL表示。

1.2.4形态鉴定

将菌株接种到PDA平板上，培养3天，观察 菌落的特征。在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上， 乳酸石碳酸棉兰染色液染色后置于显微镜下观察 (水浸片法），参照《真菌鉴定手册》[9]进行菌 种鉴定。

1.2.5 18SrDNA序列鉴定

100 mg菌丝样品于液氮中研磨至粉末，保存 于1 mL离心管中[1°]。利用酵母总DNA提取试剂 盒（天根生化科技有限公司）提取菌株总DNA, 采用 ITS 1 (5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG- 3，）和 ITS4 (5’-TCCT CGCC TTAT TGAT ATGC- 3')弓丨物扩增菌株18SrDNA转录间隔区[11]。PCR 反应体系为50 pL，程序为：94°C预变性5 min， 94。(：变性5〇8，51°(：退火5〇8,72°(：延伸2 111111, 30个循环，最后72°C延伸10 min。扩增产物经琼 脂糖电泳检测后送北京六合华大基因公司测序， 于NCBI数据库Blast比对分析。

1.2.6产酶条件的优化

首先进行产酶培养基单@素试验，保持培养 基中其他成分不变，分别改变其中的碳源、氮源、 初始pH和表面活性剂（鼠李糖脂）[12]这4个因素， 筛选出影响B-5菌株产纤维素酶的最佳单因素。 然后设计4因素3水平正交试验[13]，确定产纤维

120

陆晨，等：一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化

第6期

素酶的最优组合。

2结果与分析

2.1初筛结果

利用CMC-Na培养基分离得到9株形态不同 菌种，有细菌、放线菌和真菌。刚果红染色，均 产生大小不一水解圈，其中B-5菌株水解圈直径 与菌落直径比值并不是最大，见图1。将分离得到 9株菌接种到滤纸液体培养基培养3d后，测定滤 纸失重率，其中接种B-5的培养基中滤纸条被崩 解成不规则小片，整个培养基成糊状，见图2,滤 纸失重率为最大，达37.9%»

表1各菌株酶活大小

Table 1 Cellulase activity of each strain IU/mL

菌株A-lA-2A-3A-4B-lB-2B-3B-4B-5

FPase1.330.890.561.140.610.731.061.152.09

CMCase3.841.560.782.450.591.062.141.185.20

2.3形态鉴定

PDA培养基28°C条件下培养4天后菌落直径 达到3 cm左右，菌落起初呈粉白色，4°C保藏10 天后局部呈淡黄色，见图3。菌落表面附着孢子， 绒毛状。显微镜下观察，菌丝缠绕抱团，由单细 胞链接而成，见图4。通过菌落和菌丝特征，推测 其为一株真菌。

 

2.2复筛结果

对于以上9株菌均进行了产酶实验，它们的 FPA酶活和CMC酶活见表1,可见B-5的FPA酶 活和CMC酶活均最高。

获得B-5菌总DNA模板后，利用ITS引物在 4个退火温度梯度下（51X：、53T、551、57X：) 进行PCR反应，均得到目的扩增产物，大小700 bp左右，见图5»测序拼接后登陆Genebank进行 Blast比对，确定其为镰刀菌属，与木贼镰刀菌同 源性达99%»

2.5 B-5镰刀菌产酶条件的优化

2.5.1不同碳源对产酶活力的影响

由图6可见，利用CMC-Na为唯一碳源时， FPA酶活和CMC酶活均最高（2.09 IU/mL和5.20 IU/mL)，但稻草秸秆是天然可再生资源，并且作 为农业废物利用率较低，在实际应用方面具有优

势，故选取稻草作为唯一碳源进行产酶条件优化。 2.5.2稻草添加量对FPA酶活力的影响

由图7可见，当稻草添加量在0.5%〜2.5% 之间时，随着稻草添加量的增加，酶活不断升高。 当稻草添加量为2.5%时，FPA酶活最高为1.841 IU/mL.

2.5.3蛋白胨添加量对FPA酶活力的影响

由图8可见，当蛋白胨添加量在02%〜0.8%之 间时，随着蛋白胨添加量的增加，酶活不断升高。当 蛋白胨添加量为0.8%时，酶活最高为1.863 IU/mL。 2.5.4初始pH值对FPA酶活力的影响

保持培养基营养成分不变，当培养基的初始 pH值在酸性环境下逐渐升高时，酶活也不断升高。 当初始pH值为6.1时FPA最高为1.875 IU/mL， 见图9。

2.5.5表面活性剂对FPA酶活力的影响

保持培养基营养成分不变，分别添加〇%、 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 的鼠李糖月旨（购 买的制剂，鼠李糖脂含量为50%〜60%)。当鼠 李糖脂添加量为0.1%时，FPA酶活最高为2.067 IU/mL,见图 10。

图6不同碳源对FPA_活力和CMC酶活力的影响 Fig.6 Effects of different carbon sources on FPase and CMCase

以.5.0.5 jl.1..0.

(--1)/胺谧

.0.5.0.5 2.1.L0.

(Ils.m)/ifi«

 

图7不同稻萆添加量对FPA酶活力的影响 Fig.7 Effects of different rice straw content on FPase

〇.%.00.20.40.6- 0.81.01.21.4

蛋内胨添加量

图8不同蛋白胨添加量对FPA酶活力的影响 Fig.8 Effects of different amount of peptone on FPase

("?31)/餌避

-,15*01)/餌谳

•

°'3.03.54.04.55.05.56.06.57.0

初始pH值

图9不同初始pH值对FPA酶活力的影响 Fig.9 Effects of different initial pH value on FPase

2.5.6产酶培养基优化实验

在以上单因素实验的基础上，选取培养基初 始pH、氮源（蛋白胨）、碳源（稻草）和表面活 性剂（鼠李糖脂）这四个因素作为B-5镰刀菌产酶 过程中培养基优化的因素，设计四因素三水平的 正交试验如表2,试验结果见表3。

表2正交试验设计

Table 2 Orthogonal experimental design

水平因素

初始pH值氮源p/%碳源p/%表面活性剂P/%

14.80.620.1

25.50.82.50.2

36.11.03.00.3

表3正交试验结果 Table 3 Orthogonal test results

因素初始pH值氮源

p/%碳源

p/%表面活性剂

p/%酶活

/(IU-mL-1)

111111,257

212221.859

313331.791

421231.675

522312.042

623121.605

731321.562

832131.831

933212.205

4.9074.4944.6935.504

K25.3225/7325.7395.026

5.5985.6015.3955.297

R0.6911.2381.0460.478

各因素对FPA酶活影响的大小顺序为氮源> 碳源 > 初始pH值> 表面活性剂。从试验结果中得 出最优组合：初始pH为6.1，氮源浓度为1.0%, 碳源浓度为2.5%,鼠李糖脂添加量为0.1%,酶活 最高为 2.205 IU/mL。

° 0.00.10.20.30.40.50.6

鼠李糖脂添加量

图10不同鼠李糖脂添加量对FPA酶活力的影响 Fig.10 Effects of different rhamnolipid content on FPase

3结论

本研究从原始的自然环境采集样品，利用刚 果红染色和滤纸崩解等基础方法分离筛选出产纤 维素酶的菌种9株。鉴于细菌、放线菌和真菌的 生长形式不同，刚果红染色产生水解圈的大小并 不能作为其产纤维素酶活力高低的唯一标准，于 是利用滤纸的崩解效率进行反复验证。最后精确 测定FPA酶活和CMC酶活确定产酶最优的菌种 B-5。菌种鉴定时，首先通过观察菌落形态和菌 丝结构基本确定其为一株真菌，然后利用酵母总 DNA提取试剂盒提取其总DNA作为模板，通过 ITS1和ITS4引物扩增其18SrDNA转录间隔区， 在NCBI数据库中进行Blast比对确定其为一株镰 刀菌。在产酶优化实验中，将FPA酶活力（全酶活) 大小作为唯一标准，确定最优产酶培养基：稻草 粉末 25g/L,蛋白胨 10g/L, KH2P042g/L, CaCl2 •2H20 0.4 g/L, MgS04-7H20 0.02 g/L, Mandels 微量元素浓缩液1 mL/L, 1 mol柠檬酸缓冲液50 mL/L，鼠李糖脂添加量0.1%, pH为6.1。FPA酶活 为 2.205 IU/mL,相应 CMC 酶活为 5.174 IU/mL»

镰刀菌通常作为植物甚至农作物的致病菌进 行研究[14]，在原始森林中筛选出的B-5镰刀菌具 有较高产纤维素酶能力，利用稻草作为碳源时有 良好的产纤维素酶效果。虽然酶活离预期还有一 段距离[15]，但是通过其它的条件优化仍有提高潜 力，本研究不仅拓宽了产纤维素酶的菌谱，也为 寻求稻草秸秆新的利用途径做出了贡献。