纤维素类物质是地球上最丰富的天然有机物 质[1]，广泛存在于自然界中，占植物界总碳含量的 50%以上。一般杂草、木材和作物秸秆等都是纤维素的丰富来源，其细胞壁化学成分主要包括纤维 素、半纤维素和木质素，其中木质素常与半纤维素 以价键结合，将纤维素分子包裹在里面，形成复杂的结构体系，因此对这类物质的降解利用十分困 难[2]。目前，利用微生物发酵产生纤维素酶，将纤维素类物质转化为人类急需的能源、食品和化工原 料，已成为纤维素类资源再生利用研究的热点[3,4]。 但迄今为止，对农作物秸秆等含纤维素类物质完全降解的高活性真菌株十分缺乏，单纯的具有高纤维素酶活的菌株对农作物秸秆、杂草和木屑等的分解利 用能力不一定高[5]。因此，分离和筛选高酶活和能 有效降解自然结构的农作物秸秆纤维素的菌种显 得尤为重要。金显春等[6]以纤维素、半纤维素及稻 草的降解率为指标，筛选得到了一株对稻草秸秆有 高降解率的菌株。郝月等[7]通过测定天然纤维素酶 活，筛选出6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力 的菌株。本试验以自然界中富含纤维素、木质素分 解菌株的腐烂枝条、朽木为材料，以纤维素培养基 结合杂草、木屑进行发酵选择培养，经过多次反复 试验比较，从分离所得的多个菌株中筛选出4株较 好的纤维素分解真菌，这对研究自然界纤维素类物 质的降解利用具有重要的意义。

　　

　　1材料与方法1. 1试验材料湿润的半腐朽木及大部分内部已腐烂的猕猴 桃扦插枝条采自广西桂林植物园。

　　

　　1.2培养基①初选分离培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PSA):马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂15g,去离子水 1000mL,自然pH值。

　　

　　②复选培养基：a.竣甲基纤维素钠培养基： CMC-Na 15.0g，MS无机盐，KH2PO4 1.0g; b.滤纸平 板培养基：滤纸条，MS无机盐，KH2PO41.0g; c.纤维素 刚果红培养基[8]:(NH4)2S〇4 2.0g，MgS〇4 • 7氏0 0.5g, KH2PO4 1.0g，NaCl 0.5g,CMC-Na 2.0g,刚果红0.2g。 均添加琼脂15g,去离子水1000 mL，pH=7.0。

　　

　　③富集增殖培养基：a. MS无机盐，葡萄糖20g, 琼脂15g,去离子水1000mL，pH=7.0; b. MS无机盐，蔗 糖20g,去离子水1000mL，pH=7.0,琼脂15g; c.马铃 薯蔗糖琼脂培养基，去离子水1000mL，自然pH值。

　　

　　④液体发酵培养基：a.赫奇逊培养基(Hechisum medium)：KH2PO4 1.0g,MgSO4'7H2O 0.3g,NaCl 0.1g, CaCl2 0.1g，FeCl3 0.01g，NaNO3 2.5g; b. MS无机盐添力口 滤纸；c. MS无机盐添加CMC-Na 15.0g。均为去离子 水 1000mL，pH=7.0。

　　

　　⑤固体发酵培养基：割取野外干枯的杂草，用 1%的NaOH浸泡24h后冲洗至中性，60丈干燥后剪 成2~3cm小段，去离子水湿润装瓶；取碎小木屑刨花 用1%的NaOH浸泡24h后冲洗至中性，60丈干燥后用 去离子水湿润装瓶。

　　

　　以上培养基均在121丈湿热灭菌30min后使用。

　　

　　1.3试验方法1.3.1菌株的分离筛选将采集的内部已腐烂的 枝条、朽木用自来水冲洗表面干净后，带入室内进 行表面灭菌。先放入75%酒精中浸泡60s后，用1.0g/L HgCl2溶液消毒4~6 min,无菌水冲洗5遍，将材料切 成小段后接入PSA培养基进行培养，待菌株长出后 立即进行转接，重复多次直至得到纯菌落。将所得 到的纯菌株在竣甲基纤维素钠、滤纸和刚果红培养 基上进行复筛，选出在纤维素培养基上生长快和水 解圈大的菌株，编号保存。

　　

　　1.3.2酶活力的测定将筛选出的菌株发酵培养 一定时间后，发酵液于3000r/min离心15min,上清液 作为粗酶液。羟甲基纤维素酶（CMCase )、滤纸纤维 素酶活力（FPase)的测定及计算参照王建[9]和李日 强等™的方法。酶活定义：以每分钟产生相当1^mol 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

　　

　　1.3.3还原糖及总糖含量的测定还原糖采用 DNS法测定，总糖含量采用蒽酮-硫酸法测定™。

　　

　　1.4数据处理试验数据采用SPSS16.0软件进行处理。

　　

　　2结果与分析2.1菌株的筛选2. 1. 1菌株的分离经过多代分离提纯和反复试 验筛选比较，从自然界中的腐枝、朽木中分离得到 纤维素、木质素分解真菌4株，分别标记为F-1、F-2、 F-3和F-4。各菌株在以羧甲基纤维素钠和滤纸为限 制性碳源培养基上的生长速率见表1。

　　

　　从表1可以看出，所分离筛选的4株真菌均能在 纤维素培养基上生长，但生长速率不同。当培养4d 时，菌株F-4在羧甲基纤维素钠和滤纸培养基上生 长无差别，直径均为5.0cm;其它菌株则以在羧甲基 纤维素钠培养基上生长较滤纸培养基快，其中以 F-2、F-3直径最大，达到6.0cm, F-1直径相对最小，但 菌丝密厚。培养8d时，菌株F-1、F-3、F-4在羧甲基纤■ 226 ■广西农业科学2009年第40卷第3期维素钠培养基上均已长满整个培养皿（培养皿直快，也已长满培养皿。观测菌丝的稀疏程度，以菌株径为9cm)，而在滤纸培养基上，F-2和F-4生长最F-1最密，F-2其次，F-3、F-4菌丝较长，但十分稀疏。

　　

　　表1 4株真菌在纤维素为唯一碳源培养基上的生长速率 Table 1 Growth rates of four fungi on medium with cellulose asthe sole carbon source培养时间(d) 培养基菌株直径(cm) Diameter of colonyCultured time MediumF-1F-2F-3F-4羧甲基纤维素钠平板 CMC-Na screening plate 4滤纸平板Filter paper screening plate3.6±0.126.0±0.066.0±0.115.0±0.002.0±0.004.3±0.441.0±0.005.0±0.26羧甲基纤维素钠平板 CMC-Na screening plate8滤纸平板Filter paper screening plate9.0±0.006.4±0.209.0±0.009.0±0.005.0±0.159.0±0.005.0±0.109.0±0.00注：数据为3次重复的平均值±标准误。

　　

　　Note: Data are the average of three reduplications 士 standard error.

　　

　　2. 1.24株真菌产透明圈的大小及对滤纸的分解能力将4个菌株分别接种在纤维素刚果红平板培 养基和滤纸液体发酵培养基上，观测各菌株透明圈 的大小和滤纸的溃烂情况。由表2可知，在纤维素刚 果红平板培养基上，4个菌株均能产生透明圈，以 F-4透明圈直径最大，为1.47cm;各菌株对滤纸均有 较好的分解效果，以F-2、F-3对滤纸的分解效果最 好，且F-3分解速度最快。

　　

　　表2 4株真菌产透明圈的大小及对滤纸的分解情况 Table 2 The effects of four fungi on clear haloes and decom¬posing filter paperF-1F-2F-3F-4透明圈•二，0.67±0.03 0.93±0.03 0.67±0.07 1.47±0.03Diameter of clear haloes滤纸分解程度Extent of decomposing ++++++++++++++filter paper注：++++滤纸成均匀糊状；+++滤纸成有碎片糊状；++滤纸破裂、边缘膨胀；滤纸边缘膨胀。

　　

　　Note： ++++filter paper was decomposed into homogeneous paste； +++ filter paper was decomposed into slurry paste； ++ filter paper was de— composed and its edge was expanded； + the edge of filter paper was expanded2. 2不同培养基对4株真菌富集増殖的影响将4株真菌点接到以MS无机盐、分别添加蔗糖 和葡萄糖作为碳源的培养基以及PSA平板培养基上 进行培养，定期观测平板上菌落的直径大小及菌丝 稀疏情况。由表3可知，4个菌株在3种培养基上的生 长速率不同。培养2d时，在3种培养基上的启动生长 速度为F-4>F-3>F-1>F-2;菌株F-1在蔗糖培养基 上启动生长最快，F-3在PSA培养基上启动生长最 快，F-2、F-4在3种培养基上生长差别不明显。当培 养4d时，菌株F-1、F-2和F-3均以在PSA培养基上生 长最快，其中F-2菌落直径较小，但菌丝厚密，F-4以 在蔗糖培养基上菌落直径最大。当培养6d时，菌株 F-1、F-3和F-4在PSA培养基上已长满整个培养皿， 其中F-4在蔗糖培养基上也已长满整个培养皿，F-2 生长相对慢，未能长满整个培养皿，但菌丝较厚密。 综上可知，4个菌株适合的启动生长培养基各不相 同，但均以在PSA培养基上增殖生长最快，因此， PSA可用于4株真菌的富集增殖。

　　

　　表3 4株真菌在不同培养基上的生长情况 Table 3 The growth of four fungi on different media培养时间(d)培养基菌落直径(cm) Diameter of colonyCultured timeMediumF-1F-2F-3F-4MS+Sucrose1.1±0.030.5±0.061.4±0.122.7±0.152MS+Glucose0.6±0.200.6±0.151.5±0.372.6±0.07PSA0.8±0.130.4±0.062.4±0.072.4±0.03MS+Sucrose3.7±0.202.3±0.103.8±0.155.9±0.704MS+Glucose3.5±0.122.8±0.124.2±0.444.8±0.70PSA5.4±0.504.0±0.035.7±0.644.8±1.46MS+Sucrose5.8±0.303.0±0.105.0±0.449.0±0.006MS+Glucose6.3±0.183.8±0.175.8±0.326.3±0.09PSA9.0±0.005.1±0.039.0±0.009.0±0.002. 3不同液体发酵培养基上各菌株的产酶情况 取静置液体培养3d的各菌株上清液0.5mL分别 接种到不同的液体发酵培养基中，室温培养5d后， 取上清液作为粗酶液，测定其CMCase和FPase活 力。由表4可知，4个菌株在不同发酵培养基上培养 后所产酶液的CMCase和FPase活力不同。在无碳源 的赫奇逊液体培养基上培养后，各菌株的CMCase 活力相差不大，F-1和F-4的FPase活力略高于其他 菌株。在MS无机盐分别加入滤纸和羧甲基纤维素 钠作为碳源培养基上培养后，各菌株的酶活均有了 较大的提高，其中在滤纸培养基上，菌株F-1的CM- Case、FPase活力分别达到 199. 6U/L和 104.4U/L，明 显高于其他菌株，其他菌株之间相差不大。在以羧 甲基纤维素钠作为碳源培养基上，各菌株的CM- Case、FPase活力均有了明显提高，其中以F-1的CM- Case酶活和F-4的FPase活力最高，分别为384.4U/L 和179.7U/L。由此可见，初始培养基中添加纤维素 碳源能促进菌株产纤维素酶，且酶活高低与纤维素 种类有较大关系。

　　

　　表4 4株真菌在不同初始发酵培养基上的产酶活力Table 4 Enzymatic activity of four fungi on different fermentation media编号No.CMCase activity (U/L)FPase activity (U/L)

　　

　　abcabcF-134.5±0.05199.6±0.48384.4 ±4.5978.3±1.21104.4±0.63156.04 ±1.09F-236.1±0.12106.0±0.17189.1±0.0569.8±0.7375.3±0.58101.98±0.46F-335.1±0.05120.2±0.05308.6 ±0.2056.4±0.3573.1±0.7891.64±0.73F-434.2±0.08111.3±0.03174.5±0.1783.2±2.5575.3±0.47179.7±0.572. 4菌株在天然纤维素培养基上的生长及还原糖 和总糖含量将静置液体培养的菌株母液分别接种到已灭 菌的杂草和木屑培养基上，观测4个菌株在杂草和 木肩上繁殖生长的快慢，培养10d后测定培养基质 中还原糖和总糖的含量（表5)。结果表明，4个菌株 对杂草和木屑的降解及对产物的利用各不相同。 观察4株真菌在杂草和木屑培养基上的繁殖生长速 率，以F-3和F-1分别在杂草和木屑上的启动生长 最快，繁殖增殖速率最大。在杂草培养基上，还原 糖含量大小为F-2>F-3>CK>F-1>F-4,以F-2最高， 为1.09 mg/g;总糖含量大小为CK>F-1>F-2>F-4 > F-3,以对照最高，F-3最低。在木屑培养基上，4个菌 株发酵产物还原糖和总糖含量均明显低于对照，其 中还原糖以F-3最低，总糖以F-1最低。菌株的生长 速度与发酵产物中总糖含量大小相反，生长速率越 快，总糖含量越低。由此说明，所筛选出来的菌株能 充分利用可溶性糖作为能源物质迅速繁殖，以便有 足够的数量来启动对纤维素类物质的降解。

　　

　　表5发酵产物还原糖和总糖的含量及菌株的生长速率Table 5 The content of total sugar and reduced sugar in fermentation products and the growth rate of fungi编号No.还原糖含量（mg/g) Content of reduced sugar总糖含量（mg/g)

　　

　　Content of total sugar菌株生长快慢Growth rate of strains杂草Weeds木屑 Sawdust杂草 Weeds木屑 Sawdust杂草 Weeds木屑 SawdustCK0.64±0.010.70±0.022.52±0.141.65±0.14--F-10.43±0.010.37±0.012.38±0.120.46±0.01快 Fast快 FastF-21.09±0.080.31±0.012.30±0.070.69±0.13慢 Slow快 FastF-30.68±0.020.22±0.001.57±0.500.89±0.39快 Fast快 FastF-40.33±0.010.37±0.012.18±0.040.91±0.20慢 Slow快 Fast3结论与讨论以自然条件下腐烂的枝条、朽木为材料，结合 纤维素发酵选择培养的方法，筛选出高效稳定的纤 维素分解菌是一条有效的途径。腐烂的枝条、朽木 聚集着大量的天然纤维素降解菌群[12，13]，以纤维素 培养基结合天然杂草、木肩进行发酵选择培养，可 在保证菌株的正常生长、保持菌群稳定的同时，筛 选得到能降解杂草和木屑的菌株。本试验的结果 证明该筛选方案是可行的，得到的4株真菌在具有 较高CMCase和FPase的同时，还能在单纯的杂草和 木屑上快速启动生长并大量增殖，且生长速率与产 物中总糖含量成负相关。由此可初步判断出4株真 菌分解纤维素类物质的能力都较强，可作为筛选的 一个主要依据。

　　

　　由于纤维素酶是一种具有不同底物特异性的 多组分酶系M，因此基于本试验结果，可以考虑将4 株真菌进行选择性的组合培养，以弥补单菌发酵产 酶的缺陷[15，16]。另外，由于本试验是在不同时期、室 温静置条件下进行的菌株培养试验，因此导致菌株 生长速率不均衡，若将这4株真菌进一步进行优化 试验，以探明其最适的生长及产酶条件，或对其进 行诱变、遗传改造，势必将更大程度提高其降解 纤维素类物质的能力，从而更好地应用于生产实践。