黄原胶降解酶生产条件的优化,新分离Microbacfcrium sp XT11菌能够合成黄原肢降解酶，将植物病原菌野油菜黄单孢菌分泌的毒 素因子黄原肢分解，生成具有激发子和抗微生物活性的黄原肢寡糖。实验确认，黄原肢和酵母浸粉分别是XT11菌 生产黄原肢降解酶的最适碳源和氮源，荻得最高酶活力的最低碳源和氮源浓度均为0 3%。XT11菌生产黄原肢降 解酶的最适条件为：培养温度28°C，培养基起始阳7. Q转速150r/mii。
化学农药以快速有效和价格低廉在农业増产保 收中发挥了巨大作用，但频繁而不加区分地随意施 用也引发了生态环境污染和药物残留等危害人类健 康的严重问题[1]。因此，很多化学农药己逐渐被禁 止使用。寡糖作为生物农药具有对人类和生态环境 无害、不易产生抗药性、可生物降解等优点，已成为 生物农药的发展方向。人76^等[2]首先发现病原菌 大雄疫霉细胞壁碎片中的寡糖能够诱导植物合成植 保素，抵御植物病原菌的侵染[3]。寡糖也能够控制 植物病原菌感染，具有抗微生物活性[4]。目前己成 功研究的活性寡糖主要包括0-葡聚糖寡糖、几丁 质脱乙酰几丁质寡糖、果胶质寡糖和木葡聚糖衍生 的寡糖等，黄原胶降解酶生产条件的优化,但所有这些寡糖都是从病原菌或植物细 胞壁的结构多糖中分离出来的[5]。黄原胶是由植 物病原菌野油菜黄单孢菌分泌的一种胞外多糖，与 这些细胞壁多糖具有相似的结构特征[6]，推测黄原 胶降解物也可能有类似的生理功能[7]。
从土壤中得到的一株黄原胶降解菌M ^obacfc- nun sp XT11，能够降解黄原胶分子[8]。所形成的 黄原胶寡糖具有激发子活性，诱导植物的自我防御 响应[9]。同时也具有抗微生物活性，抑制野油菜黄
单孢菌的生长并阻止黄原胶分泌[1〇]。更有意义的 是，黄原胶是野油菜黄单孢菌引起植物黑腐病的毒 素因子[11],而黄原胶降解产物却对黄原胶生产菌有 抗菌活性[1〇]。这是继细胞壁多糖降解物被证明具 有生物活性后,我们首次报道植物病原菌毒素因子 的降解物也同样具有生物活性[7]。研究结果表明， 黄原胶寡糖在植物黑腐病防治中是一种潜在有价值 的生物控制剂[10],本文将主要研究XT11菌合成黄 原胶降解酶的生产条件优化及影响因素。
2材料与方法
2 1黄原胶降解菌与培养方法
黄原胶降解菌M icrobacteriUm sp XT 11由本实 验室从土壤中分离纯化并保存。
基础培养基组成：250mg CaCl, 250 mg K2HPO4, 400mgNaC! 125mgMgS〇4, 350mgKN〇3, PH7 0 1 000ml蒸馏水。
种子培养基组成：2g黄原胶，1g葡萄糖，0 5 g 酵母浸粉，1 000 ml基础培养基。
生产培养基组成：3g黄原胶，2g酵母浸粉，1 000ml基础培养基。
培养方法:挑取一环新鲜斜面保存菌种,接种于 种子培养基中，30°C摇床培养（150 r/min)约9h使 OD600接近0 8后，按2%接种量接种黄原胶降解 菌于液体培养基中，30°C摇床培养（转速为150 r/ min)，分别在18^24和30h取样测定发酵液的菌体 浓度和上清液中的黄原胶降解酶活力。
2 2分析方法
菌体浓度采用浊度法测定，并用600 nm处的光 吸收表示；还原糖浓度按Milfer[12]描述的方法，取
02ml待测溶液与等体积的3 5二硝基水杨酸试 剂混和后，于沸水浴中加热5m in立即冷却，补水至
15ml在520纳米处测定吸光度值;粘度采用黄原 胶溶液在移液管中的沉降速度表示，取一支0 2 ml 的移液管吸取待测溶液至满刻度，记录溶液由0刻 度下降到0 1m该U度所需要的时间，并以时间“秒” 为粘度计量单位。
23黄原胶降解酶活力测定
将0. 4ml发酵上清液与等体积溶于100 mM磷 酸缓冲溶液（pH 7 0)的0 5%黄原胶溶液混合后， 应，测定反应液粘度t。将发酵上清液沸水浴中煮 沸5m n使酶失活，重复上述实验并记录为t)，两次 实验的粘度差值At= tc-l!用于计算酶活力。
酶活力单位定义为:在上述酶反应条件下，使黄 原胶溶液的粘度每下降一个粘度单位所需要的酶量 为一个酶活力单位（U)。
3结果与讨论
31碳源对黄原胶降解酶生产的影响
用终浓度为0 5%的不同碳源分别代替生产培 养基中的黄原胶，黄原胶降解酶生产条件的优化,培养黄原胶降解菌XT11测定培 养液中的黄原胶降解酶活性，所研究的碳源包括葡 萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、黄原胶、蔗糖、乳糖、羧甲 基纤维素、乙醇、甘露糖、甘露醇、琼脂（0 3%)和海 藻酸钠。不同碳源培养基中XT11菌生产的最大黄 原胶降解酶活力如图1所示。以黄原胶为碳源时发 酵上清液中的黄原胶降解酶活力最高，在海藻酸钠 和琼脂为碳源的培养基中也能够检测到黄原胶降解 酶活性，但以葡萄糖、麦芽糖或蔗糖为碳源培养 XT11菌时则完全不产黄原胶降解酶。
当以黄原胶为碳源由XT11菌生产黄原胶降解 酶时，黄原胶浓度不同,所合成的黄原胶降解酶量也 不相同。当黄原胶浓度为0 3%时,黄原胶降解酶 活力达到最大，再增加碳源浓度对黄原胶降解酶生 产的影响可以忽略。
3 2氮源对XT11菌产酶的影响
于40°C水浴中反应40min沸水浴加热5m in终止反bl白胨、甘氨酸、牛肉膏、尿素、硝酸铵、磷酸氢二铵和
用不同的氮源（终浓度为0 2% )代替生产培养 基中的酵母浸粉,分别研究不同氮源如蛋白胨、胰蛋
硫酸铵等对黄原胶降解酶生产的影响，结果如图2 所示。由图中结果可知，当以酵母浸粉为氮源时， XT11菌的黄原胶降解酶生产能力最大。而在以蛋 白胨、磷酸氢二铵或硫酸铵为氮源的培养基中则完 全不产黄原胶降解酶。
在以酵母浸粉做生产培养基中的氮源时，分别 考察了酵母浸粉不同浓度对黄原胶降解酶生产的影 响。当酵母浸粉浓度为0 3%时，培养液中的黄原 胶降解酶活力达到最高值,继续提高氮源浓度时，黄 原胶降解酶活力几乎没有任何变化。
3 3培养温度与黄原胶降解酶生产的关系
将XT11菌接种于生产培养基中，分别于不同 温度条件下培养，考查发酵温度对黄原胶降解酶生 产的影响。正如图3中结果，在所测定的培养温度 范围内（20〜36°C)，温度对XT11菌的黄原胶降解 酶生产没有明显影响，其中以28°C培养时，黄原胶 降解酶产量最大。
3 4溶氧对XT11菌产酶能力的影响
在250m啲三角瓶中加入60ml生产培养基，接 菌后于30°C摇床内，黄原胶降解酶生产条件的优化,分别采用不同的转速培养 XT11菌，检测溶氧条件对黄原胶降解酶生产的影 响，结果如图4所示。摇瓶转速对黄原胶降解酶的 生产并没有十分明显的影响，转速为100 r/min时 的黄原胶降解酶生产比最高酶活力时低不到20%。
35培养基初始pH对黄原胶降解酶生产的影响 将生产培养基的洱值分别调到5 (、5 乂6 a 6 乂 7 0和7 5后接菌培养，以考察不同初始pH值 与黄原胶降解酶生产的相互关系。由图5结果可以 看出，当洱低于6 5时，XT11菌合成黄原胶降解 酶的能力随pH的升高而增加，当初始pH值达到 6 5〜7 5时酶生产能力为最大。
36黄原胶降解酶生产曲线
根据上述影响M icrobacterium sp XT 11菌生产 黄原胶降解酶因素的研究，可以确定XT11菌较好 的酶生产培养基应该是含有0. 3%黄原胶和0. 3% 酵母浸粉的基础培养基（pH7. 0)。
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